蕓豆酵素復合發酵工藝優化

王 迪 王 穎,2 張艷莉 劉淑婷 佐兆杭

(1. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319； 2. 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319)

蕓豆作為一類典型的低鈉高鉀鎂類食品，富含蛋白質、碳水化合物、脂肪、膳食纖維等人體必需的營養物質[1-2]，還含有多種球蛋白、堿性皂體及活性肽等成分[3]，具有極高的食用及藥用價值。

酵素在中國、日本等亞洲國家風靡。中國生物發酵產業協會發布的《酵素產品分類導則》標準中，將酵素定義為以動物、植物和食用菌等為原料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素產品[4]。按照原料種類，可分為單一酵素和復合型酵素，生產原料多為蔬菜、水果、谷物及藥食同源類物質，常通過自然發酵或人工接種兩種方式制成[5]。酵素作為營養機能食品生理功能突出，可通過調節內源性膽固醇的合成，有效改善由于肥胖造成的脂肪組織的慢性和全身性低度炎癥[6-8]；還具有美白抗氧化[9]、消炎抗菌[10]、解酒護肝、清腸助消化等生理功能。秦松等[11]研究了混合菌種發酵的植物酵素顯著提高三酰甘油的活性，保護小鼠酒精性肝損傷，驗證植物酵素的抗氧化性。Aruoma等[12]研究表明，木瓜酵素對經H2O2氧化后造成DNA損傷的嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞有調節作用，改善細胞形態并提高細胞生命力。戰偉偉等[13]對藍靛果椰子復合酵素發酵工藝進行優化，優化后SOD酶活力為56.74 U/mL。中國目前尚未見蕓豆酵素復合發酵工藝優化相關的研究。試驗擬以黑龍江地區主產蕓豆為原料制備酵素，探討最優發酵工藝，提高蕓豆附加值，深度挖掘生理功能，為植物酵素產品未來發展提供技術參考及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆：黑龍江省黑河市；

白砂糖：市售；

安琪牌活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；

植物乳桿菌(LP)、保加利亞乳桿菌(LB)：東北農業大學菌庫；

嗜酸乳桿菌(LA)、鼠李糖乳桿菌(LR)：中國工業微生物菌種保藏中心；

耐高溫α-淀粉酶(酶活力2.0×104U/g)、糖化酶(酶活力1.0×104U/g)：上海源葉生物科技有限公司；

SOD酶活力檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

電子天平：BS224S型，賽多利斯科學儀器有限公司；

料理機：JYL-Y912型，九陽股份有限公司；

pH計：S220型，瑞典波通儀器公司；

電熱鼓風干燥箱：DGG-9023A型，上海森信實驗儀器有限公司；

可見分光光度計：V-5100B型，上海元析儀器有限公司；

數顯電熱恒溫水浴鍋：HH-1S型，上海達洛科學儀器有限公司；

電熱恒溫培養箱：DRP-9082型，上海培因實驗儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-30SII型，濟南捷島分析儀器有限公司；

臺式高速離心機：TG16-WS型，常州金勝儀器制造有限公司；

超凈工作臺：BCV-6S1型，浙江賽德儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

蕓豆去皮清洗→打漿均質→液化→糖化→離心→滅菌→接種→發酵→后發酵

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酵母菌、乳酸菌

1.3.2 菌種的活化與培養 取4 ℃下斜面保存的乳酸菌于MRS液體培養基中，37 ℃下厭氧培養24 h，菌懸液待用?；钚愿山湍赣?0倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，菌液待用。

1.3.3 發酵基質的制備 紫花蕓豆清洗后去皮，按1∶3(g/mL)料水比打漿。α-淀粉酶和糖化酶雙酶法進行水解，通過前期預試驗獲得液化和糖化條件。液化條件：α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH 6.0、酶解溫度97 ℃、時間20 min；糖化條件：加酶量200 μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時間30 min。酶解液于高速離心機中以1.0×104r/min離心15 min，得到蕓豆清汁。調清汁pH為5.0，添加8%白砂糖后滅菌備用。

1.3.4 接種與發酵

(1) 乳酸菌發酵：蕓豆清汁中接種3.0%不同種乳酸菌，37 ℃培養36 h，其他條件相同。

(2) 酵母菌發酵：30 mL蕓豆清汁裝于250 mL錐形瓶中，接種0.20%酵母菌，30 ℃條件下，180 r/min振蕩培養28 h。

(3) 復合發酵：按照1.3.7接種發酵蕓豆清汁，發酵后4 ℃低溫靜置使其產香。

1.3.5 酵母菌單獨發酵工藝優化

(1) 發酵時間：在初始裝瓶量30 mL、pH 5.0、接種量0.20%的條件下，分別發酵8，16，24，32，40 h，測定發酵液SOD活力及酵母菌活菌數。

(2) 接種量：在初始裝瓶量30 mL、pH 5.0的條件下，分別接種0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%酵母菌，發酵24 h后測定發酵液SOD活力及活菌數。

(3) 裝瓶量：在初始裝瓶量30 mL、pH 5.0、接種量0.20% 的條件下，250 mL錐形瓶中分別裝30，40，50，60，70 mL發酵液后接種酵母菌，發酵24 h后測定SOD活力及活菌數。

1.3.6 乳酸菌單獨發酵工藝優化

(1) 發酵菌種及發酵時間：保證蕓豆清汁初始pH 5.0，接種3.0%不同乳酸菌菌液于蕓豆清汁中，37 ℃下分別發酵6，12，18，24，30，36 h，結束后測定發酵液中活菌數。

(2) 接種量：在初始pH 5.0、發酵溫度37 ℃條件下，分別接種1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%菌液，LB、LA、LR和LP分別于發酵12，18，24，30 h后測定發酵液活菌數。

(3) 復配比例及發酵時間：在初始pH 5.0、發酵溫度37 ℃條件下，將上述兩種最優乳酸菌分別按3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3比例接種，分別于發酵18，24，30 h時測定發酵液活菌數。

1.3.7 復合發酵 分別采用3種方式進行復合發酵：① 先接種0.20%酵母菌，30 ℃條件下以180 r/min振蕩培養進行預發酵，接種3.0%復合乳酸菌，37 ℃培養一定時間；② 先接種3.0%乳酸菌進行預發酵，后接種0.20%酵母菌；③ 同時接種0.20%酵母菌和3.0%乳酸菌，37 ℃培養。以SOD活力為指標，確定最佳發酵時間及接種順序。

1.3.8 測定項目及方法

(1) 乳酸菌活菌數：按GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》執行。

(2) 酵母菌菌體濃度：采用血球計數板法[14]。

(3) SOD酶活力：采用SOD酶活力試劑盒測定。

1.4 數據處理

試驗均進行3次重復操作，采用Origin 8.0、Design Expert軟件對數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌單獨發酵工藝優化

2.1.1 發酵時間的確定 酶活是衡量發酵體系是否達到成熟的指標之一，是酵素行業廣泛測試的營養指標[15]。因后期考察蕓豆酵素對肥胖方面的影響，故選用SOD活力作為參考指標。由圖1可知，隨著發酵時間的延長，酵母菌活菌數顯著升高，24 h后趨于穩定。SOD活力也呈現顯著上升至穩定的趨勢。發酵液中的營養物質是酵母菌發酵必備代謝基質，其利用率顯著提高，未滿足酵母菌生長發酵條件，活菌數不再增多。因此確定發酵時間為24 h。

圖1 發酵時間對SOD活力及活菌數的影響

2.1.2 接種量的確定 由圖2可知，隨著接種量的增加，發酵液中SOD活力及活菌數逐漸提高，當接種量為0.20%時，SOD活力和酵母菌濃度分別達到78.82 U/mL和8.5×108CFU/mL，當接種量超過0.20%時，活菌數及SOD活力顯著降低。酵母菌發酵主要利用碳源產生次級代謝產物，碳源缺乏阻礙酵母菌的繁殖與發酵，其生長速率低于衰亡速率，故酵母菌降低。因此確定酵母菌接種量為0.20%。

圖2 接種量對SOD活力及活菌數的影響

2.1.3 裝瓶量的確定 由圖3可知，SOD活力與活菌數隨裝瓶量的增加而顯著降低。酵母菌產酶與發酵液中溶氧量密切相關，隨著裝瓶量增加，體系中溶氧量減少，酵母菌生長受到限制，無氧條件下發酵產生乙醇。后期試驗需在不同發酵時間多次取樣，且從經濟角度考慮確定裝瓶量為30 mL。

圖3 裝瓶量對SOD活力及活菌數的影響

2.2 乳酸菌單獨發酵工藝優化

2.2.1 菌種的選擇 由圖4可知，LA活菌數在18 h時達到最大，可達1.86×1010CFU/mL，說明在發酵過程中其生長性能較好，此時高于其他3種乳酸菌活菌數。LB活菌數在12 h達最大，其遲緩期較短，進入對數生長期較快。LP在30 h時得到最大活菌數，雖發酵時間最長，但高于其他3種乳酸菌。綜上，LB、LA、LR和LP最優發酵時間分別為12，18，24，30 h。

圖4 不同菌種發酵過程中活菌數的變化

Figure 4 Changes in the number of viable bacteria during the fermentation of different strains

2.2.2 接種量的確定 由圖5可知，LB在1.5%的接種量時活菌數達到最高。當接種量為2.0%時，LR活菌數最高，可達到14.3×109CFU/mL。LP和LA最佳接種量均為3.0%，且此時活菌數均高于LB和LR的最大活菌數。乳酸菌具有維持微生態平衡、提高生物效價及控制機體內毒素等生理功能，含量越高其價值越高。考慮乳酸菌之間可能存在共生作用，將具有較高活菌數的LA和LP按一定比例復配發酵，以期蕓豆酵素具備更高生理活性。乳酸菌接種量過多時活菌數下降，由于過量乳酸菌在發酵過程中產酸抑制其本身的生長，取3.0%作為復配菌種發酵的接種量。

2.2.3 復配比例及發酵時間的確定 由圖6可知，LP與LA的比例為1∶3時，發酵18 h高于24 h和30 h的活菌數，此時復配菌種中LA所占比例更大，發酵18 h達到LA對數生長期，菌數積累。復配菌種發酵30 h時，LA進入生長衰退期，此時LP適應新環境后快速繁殖并積累發酵產物，生長速度快。LP和LA以1∶1比例復配，發酵24 h達最大活菌數，此時活菌數與發酵時間無關，可能是兩種菌間存在共生作用，相互利用產生有機酸及次生代謝產物[16]。因此最佳發酵時間24 h，復配比例為1∶1。

圖5 不同菌種的接種量對活菌數的影響

圖6 復配比例及發酵時間對活菌數的影響

2.3 復合發酵

與厭氧發酵的乳酸菌不同，酵母菌正常增殖發酵需要發酵液溶氧量充足[17]。酵母菌與乳酸菌發酵溫度存在差異，同時接種無法達到益生菌各自最優條件。若先接種乳酸菌，酵母菌生長不良，發酵液感官評定較差。由于乳酸菌對營養物質的利用率較高，酵母菌未利用碳源產生相關代謝產物，發酵液發酵不完全，且乳酸菌發酵時間過長，乳酸菌活力會自溶或衰亡。故選擇先接種酵母菌進行預發酵，后接種乳酸菌的發酵方式。

由圖7可知，接種酵母菌24 h，發酵液SOD活力達最高并趨于穩定，此時接種乳酸菌進行后續發酵。24～48 h時SOD活力顯著升高，可達224.09 U/mL。酵母菌與乳酸菌之間存在互利共生作用。酵母菌產生出具有中鏈脂肪酸的甘露糖，促進了乳酸菌的生長，而乳酸菌代謝產物乳糖又為酵母菌的生長提供了碳源。乳酸菌還可通過丙酮酸鹽裂解酶將丙酮酸鹽轉化為甲酸鹽，或者將檸檬酸鹽分解為乳酸鹽、乙酰甲基原醇、雙乙酰、2,3-丁二醇等芳香物質，使發酵體系產香[18]。研究[19]表明，在高滲透壓、高溫、較低pH值等環境下，酵母菌會產生“交叉保護”，其實是酵母菌與乳酸菌共生體系中存在一種適應反應機制，這種機制一旦被激活，會促使酵母菌提升對外界環境的抵抗能力。故在發酵體系中，益生菌未產生自溶現象，二者緊密聯系，達到互利共生的狀態，蕓豆發酵液形成穩定的平衡體系。

圖7 復合發酵對SOD活力的影響

3 結論

試驗以紫花蕓豆為發酵原料，經酵母菌、復合乳酸菌多菌種共同發酵得到SOD活力較高的蕓豆酵素產品。酵母菌單獨發酵情況下發酵時間、接種量及裝瓶量的試驗條件優化，并優化乳酸菌發酵菌種、接種量及復配比例和發酵時間，確定植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌以1∶1比例復合發酵。采用先酵母菌進行預發酵后接種乳酸菌的發酵順序，最優發酵條件為：在pH 5.0、接種量0.20%、裝瓶量30 mL(250 mL)的條件下，30 ℃振蕩培養24 h；再接種1.5%植物乳桿菌和1.5%嗜酸乳桿菌，37 ℃培養24 h；4 ℃低溫靜置24 h使酵素產香。在此條件下，SOD活力可達224.09 U/mL，益生菌發酵產生次生代謝產物，反應體系走向成熟。后期將對蕓豆酵素功能特性進行研究，以探究其生理功能。