好食脈孢菌固態發酵醋糟產木聚糖酶的工藝優化

段 睿 鄧永平,2 劉曉蘭,2 鄭喜群 姜歡笑 馬 瑞

(1． 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2． 黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319)

木聚糖是植物細胞壁中最豐富的半纖維素，是自然界中僅次于纖維素的多糖[1]。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)可將木聚糖水解成不同長度的低聚木糖和D-木糖[2]，在工業上應用廣泛，如用于紙漿改性[3]、生產生物燃料[4]、澄清果汁[5]、提升飼料質量[6]以及生產木糖醇[7]等。2019年1月3日，澳新食品標準局發布70-19號通告，擬批準來自里氏木霉轉基因菌株的木聚糖酶作為烘焙產品生產中的加工助劑[8]。

醋糟為釀造食醋后的廢棄物，年產量巨大。由于難降解，纖維含量高，營養價值低，在養殖業中很難達到像酒糟、豆渣等糟渣類原料的高利用率；且由于酸度高，直接排放又易造成環境污染[9]。好食脈孢菌是一種子囊菌屬真菌，生長速率快，為常見工業真菌黑曲霉和產黃青霉的2～3倍[10]。好食脈孢菌是FDA組織認證的安全性真菌[11]，已見關于好食脈孢菌降解纖維類底物富集蛋白質及產纖維素酶等產物的報道[12-14]。課題組前期報道了好食脈孢菌發酵產木聚糖酶的工藝[15-16]，原有工藝分別是采用液態發酵和固態發酵產酶，所使用的培養基配方較復雜，且生產成本有進一步降低的空間。

由于固態發酵往往具有比液態發酵更高的產酶活力[17]，試驗擬以富含纖維的釀醋廢棄物醋糟為發酵底物，經好食脈孢菌固態發酵生產木聚糖酶，對發酵培養基組成及培養條件進行優化，以期為木聚糖酶提供安全、價廉的新來源，也為醋糟的利用提供新途徑，提高釀醋行業經濟效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

好食脈孢菌(Neurosporasitophila)：齊齊哈爾大學食品與生物工程學院生物工程教研室菌種保藏室提供，分離自北方發酵豆制品。

1.1.2 材料與試劑

醋糟：齊齊哈爾市黑龍釀造有限責任公司；

木聚糖：美國Sigma公司；

其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-SG46-280S型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

高速冷凍離心機：Himac CF15RX型，日立(中國)有限公司；

隔水式電熱恒溫培養箱：PYX-DHS·350-BS-Ⅱ型，上海躍進醫療器械廠；

分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

(1) 斜面培養：培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，配制方法參照文獻[18]。將4 ℃保存的好食脈孢菌菌株挑取至PDA斜面上，28 ℃培養3～5 d。

(2) 固態發酵培養：在250 mL三角瓶中裝入5 g干醋糟，其他原料及配比根據試驗確定。

1.2.2 氮源種類對木聚糖酶活力的影響 培養基碳源為5 g醋糟，氮源分別為1%醋糟質量的玉米蛋白粉、豆粕、干豆渣。料水比1∶3 (g/mL)，初始pH為培養基自然pH，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL(含孢子量106個/mL)，28 ℃恒溫培養3 d后測定木聚糖酶活力。

1.2.3 干豆渣濃度對木聚糖酶活力的影響 調節培養基中干豆渣濃度分別為醋糟質量的0%，1%，2%，3%，4%，6%，8%，10%。將5 g干醋糟與上述不同濃度干豆渣加入到250 mL三角瓶中，料水比1∶3 (g/mL)，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL(含孢子量106個/mL)，28 ℃ 培養3 d后測定木聚糖酶活力。

1.2.4 培養基料水比對木聚糖酶活力的影響 250 mL三角瓶中加入5 g醋糟和0.4 g干豆渣，調節培養基的料水比分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL(含孢子量106個/mL)，于28 ℃培養3 d后測定木聚糖酶活力。

1.2.5 培養時間對木聚糖酶活力的影響 250 mL三角瓶中加入5 g醋糟和0.4 g干豆渣，調節培養基的料水比分別為1∶3 (g/mL)，滅菌后接入好食脈孢菌孢子懸液1 mL (含孢子量106個/mL)，于28 ℃培養2，3，4，5 d后測定木聚糖酶活力。

1.2.6 正交試驗優化 利用L9(34)正交試驗對好食脈孢菌產木聚糖酶的培養基初始pH、培養溫度和接種量進行優化。

1.2.7 粗酶液的制備 培養結束后，向固態發酵培養物中加入100 mL生理鹽水，180 r/min浸提酶2 h。浸提結束后，過濾，在4 ℃、10 000 r/min離心10 min，得粗酶液。

1.2.8 酶活力的測定 參考GB/T 23874—2009方法，對酶促反應的溫度和pH稍作修改。酶活力定義為在40 ℃、pH 6.0條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol還原糖所需酶的量為一個酶活力單位，用U/g表示。

1.3 數據統計分析

所有試驗均重復3次，利用Excel 2003和SPSS軟件對數據進行統計分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的測定

由圖1可知，標準曲線R2為0.998 4，可用于好食脈孢菌固態發酵醋糟產木聚糖酶活力的測定。

2.2 氮源種類對木聚糖酶活力的影響

由圖2可知，當以豆渣為氮源時，好食脈孢菌產木聚糖酶活力顯著高于玉米蛋白粉和豆粕的(P<0.05)，可能是豆渣中含有較高含量的膳食纖維(干基中約含60%)[19]，在發酵中起到了木聚糖酶誘導物的作用。

圖1 木糖標準曲線

圖2 氮源種類對木聚糖活力的影響

2.3 豆渣濃度對木聚糖酶活力的影響

由圖3可知，隨著豆渣濃度的提高，酶活力顯著提高(P<0.05)，當培養基中豆渣添加量為醋糟質量的8%時，木聚糖酶活力最高；當繼續增加豆渣濃度至10%時，培養基狀態較為黏稠，氧氣流通性變差，不利于好氧菌的生長代謝，導致酶活力有所降低，與黑曲霉固態發酵豆渣生產纖維素酶及淀粉酶的研究結果[20]相似。因此，確定培養基中豆渣濃度為醋糟質量的8%。

圖3 豆渣濃度對酶活力的影響

2.4 培養基料水比對木聚糖酶活力的影響

大多數絲狀真菌在固態基質表面或內部的生長狀態取決于固態基質的孔隙率[21]。培養基料水比對于營養物質的溶解狀態，以及培養基的孔隙率均會有較大的影響，進而對菌體生長和活性物質的積累產生一定的影響。由圖4可知，當料水比為1∶3 (g/mL)時，木聚糖酶活力顯著高于其他料水比的(P<0.05)，達400.19 U/g；繼續加大培養基含水量會導致酶活力顯著降低(P<0.05)，因此，確定料水比為1∶3 (g/mL)。

2.5 培養時間對木聚糖酶活力的影響

由圖5可知，隨培養時間的延長，木聚糖酶活力呈先升高后逐漸降低的趨勢，培養至3 d時酶活力顯著增高(P<0.05)，之后無顯著性變化(P>0.05)，因此，確定培養時間為3 d。

圖4 培養基料水比對酶活力的影響

Figure 4 Effect of the solid-liquid ratio of culture media on enzyme activity

圖5 培養時間對酶活力的影響

2.6 正交試驗優化

溫度、培養基pH和接種量是影響固態發酵效率的3個主要因子[22]。其中，溫度的影響尤為顯著，低溫培養減緩菌絲代謝速率，延長生產周期，高溫培養易導致菌絲快速老化，抑制產物生成，適宜絲狀真菌產木聚糖酶的培養溫度大多在23～35 ℃[23]；培養基pH影響物質的膜間運輸，固態發酵過程主要研究培養基的初始pH值對產物的影響[24]，絲狀真菌的最佳生長和產酶的初始pH范圍大多在3.8～6.0[22]；接種量對于維持固態發酵中菌絲生長和產物合成的平衡具有重要影響，接種量過小會導致生物量過低，而接種量過大會導致不必要的真菌生長和養分消耗，兩種情況均導致酶的產量低下[25]，固態發酵中采用的孢子接種量通常為105～107個孢子/g干基[22]。在前期預試驗的基礎上對好食脈孢菌發酵醋糟豆渣產木聚糖酶的培養基初始pH、培養溫度和接種量進行正交試驗分析，試驗因素水平設計見表1，試驗結果及方差分析分別見表2、3。

由表2可知，好食脈孢菌固態發酵醋糟獲取木聚糖酶的最優培養條件組合為：培養基初始pH 5.5、培養溫度28 ℃，接種量106個孢子/瓶，影響木聚糖酶活力的主次因素依次為培養溫度>初始pH值>接種量。

由表3可知，培養溫度對木聚糖酶活力有顯著影響(P<0.05)，初始pH、接種量對木聚糖酶活力無顯著影響。

最終確定好食脈孢菌發酵醋糟制備木聚糖酶的條件為：5 g醋糟與0.4 g干豆渣組合，料水比1∶3 (g/mL)，培養基初始pH 5.5，接種量106個孢子/瓶，28 ℃發酵3 d。

表1 正交試驗設計

表2 L9(34) 試驗結果

表3 木聚糖酶方差分析結果?

? *表示差異顯著(P<0.05)。

該條件下產酶活力為412.34 U/g，較優化前(114.95 U/g)提高了約3.59倍。

3 結論

以釀造食醋下腳料醋糟為主要原料，利用好食脈孢菌固態發酵生產木聚糖酶，得到固態發酵培養基組成和培養條件：5 g醋糟與0.4 g干豆渣組合，料水比1∶3(g/mL)，培養基初始pH 5.5，接種量106個孢子/瓶，28 ℃ 發酵3 d。此條件下產木聚糖酶活力為412.34 U/g，較優化前(114.95 U/g)提高了約3.59倍。

將醋糟廢物再利用，作為原料用于木聚糖酶的生產，有助于降低酶的生產成本，且醋糟中的半纖維素經微生物降解可為木聚糖酶提供誘導物，有助于進一步提高酶活力；同時，采用FDA認證的安全菌種好食脈孢菌作為生產菌種，提高了木聚糖酶的安全性，可進一步將其開發為食品或飼料用酶制劑。木聚糖酶是一種誘導酶，在培養基中添加適量的生物或非生物誘導子對酶活力的提高具有一定的促進作用，后續可進一步研究誘導子對酶活力的影響，以期能更大幅度地提高木聚糖酶活力。