重組釀酒酵母發酵生產瓦倫西亞烯及其衍生物

歐陽小丹，李文，察亞平，朱晁誼，李爽

(華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州，510006)

瓦倫西亞烯及圓柚酮均屬于倍半萜類化合物。瓦倫西亞烯分子式為C15H24，淡黃色澄清液體，具有甜橙油特征香氣。一直是推動消費者偏好眾多產品的關鍵因素，產品包括食品、飲料、香水個人護理和家人護理用品[1-2]。同時，瓦倫西亞烯也是生產圓柚酮的重要前體。圓柚酮，分子式C15H22O，它是葡萄柚和柑橘衍生的氣味香氣成分的主要貢獻者，具有相對較低的香味閾值，通常在柑橘類冷榨油或精油中經提純得到[3]。目前已被FDA和EPA批準，可以用于調配橙子、圓柚、熱帶水果等實用香精和煙用香精。因為圓柚酮具有很好的揮發性，并且它對人體無害，所以圓柚酮還被公認為環境友好型的殺蟲劑[4-6]。故 2014年，CDC正式批準兩家公司可以生產圓柚酮類殺蟲劑。近年來研究發現圓柚酮不僅具有抑制癌細胞增生和抗血小板凝集的效果[7]，還可以防止因空氣污染引起的呼吸系統疾病[8]。

圓柚酮的生產方法主要有3種：植物提取法、化學合成法和生物催化轉化法[7, 9]。萜類化合物在植物中的含量通常都很低，植物提取法對野生植物資源易造成嚴重破壞，且其作物的種植加工受到氣候、環境、運輸等諸多因素的影響，使得圓柚酮香料在產量、質量、價格方面存在不可控的變化，經濟可行性較差。目前，工業上常常通過直接氧化價格相對便宜的前體物質瓦倫西亞烯來獲得圓柚酮。但是，該反應過程通常涉及一些非環境友好的氧化劑，如三氧化鉻等重金屬鹽類[10]，相比之下，生物催化轉化方法不受原料的限制、生產過程綠色清潔，具有很大的優勢[11]。

綜上所述，在微生物體內重構瓦倫西亞烯及其衍生物圓柚酮的生物合成途徑，以獲得高產瓦倫西亞烯及圓柚酮的菌株極具現實意義。2011年，CANKAR等在釀酒酵母WAT11中異源表達來源于黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶，獲得1.36 mg/L的瓦倫西亞烯[12]。EMMERSTORFER等通過在釀酒酵母W303中異源表達圓柚酮生物合成途徑中的幾個關鍵酶，總萜產量達31 mg/L[13]。2018年，GUO等利用解酯耶式酵母作為宿主菌株，5 d后瓦倫西亞烯和圓柚酮的產量分別達22.8、0.98 mg/L[9]。基于釀酒酵母被公認為安全的模式生物，本研究在釀酒酵母PK2-1Ca中引入圓柚酮的生物合成途徑，結合代謝工程策略，優化代謝通路，旨在進一步提高瓦倫西亞烯及其衍生物的產量，為利用釀酒酵母規模化生產瓦倫西亞烯及其衍生物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒和菌種

質粒和菌種如表1、表2所示，本實驗用到的出發菌株包括購于英濰捷基的E.coliDH5(F-φ80 lacZ ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169recA1endA1hsdR17 (rK-, mK+)phoAsupE44 λ-thi-1gyrA96relA1)，購于ATCC?MYA-1108TM的CEN.PK2-1Ca(MATatrp1-289leu2-3leu2-112ura3-52his3Δ1)及實驗室保存的CEN.PK2-1Ca-M(MATatrp1-289leu2-3leu2-112ura3-52his3Δ1erg9::Δ-220—176rox1::mut)。

表2 試驗所用菌株Table 2 Strains that used in this study

1.1.2 主要試劑

本文重組表達載體構建過程中所用到的各種限制性內切酶、DNA marker、2×PrimerSTAR Max Premix:Takara公司；2×DreamTaq Green PCR Master Mix:上海Thermo Fisher Scientific公司；T4 DNA ligase:NEB公司；KOD FX:日本TOYOBO公司；快速質粒小提試劑盒:天根(北京)股份有限公司；Cycle-Pure Kit:Omega股份有限公司；酵母轉化試劑盒:英濰捷基；基因、引物合成及測序:由生工生物工程股份有限公司完成；瓦倫西亞烯、圓柚醇、圓柚酮標準品:上海梯希愛化成工業發展有限公司。

1.1.3 培養基

LB液體培養基(g/L)：NaCl 5，酵母提取物5，蛋白胨10。LB/Amp+抗性培養基：以體積比1∶1 000加入氨芐青霉素(100 g/L)。YPD液體培養基(g/L)：酵母提取物10，葡萄糖20，蛋白胨20。SD液體培養基(g/L)：無水葡萄糖20，體積比1∶10加入10×酵母氮源(YNB)貯液和10×DO添加劑貯液。按需要添加相應的氨基酸。SG液體培養基(g/L)：半乳糖20，體積比1∶10加入10×酵母氮源(YNB)貯液和10×DO添加劑貯液。根據需要按體積比1∶100添加相應的100×氨基酸貯液。固體培養基則在此基礎上添加2%(質量分數)瓊脂粉。

1.1.4 儀器與設備

PCR基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；小型高速離心機，美國Thermo公司；UV-2100型分光光度計，UNICO公司；生化培養箱，上海精密科學儀器有限公司；恒溫搖床，上海蘇坤實業有限公司；超低溫冰箱，美國Thermo公司；水平型電泳槽，上海天能科技有限公司；超微量分光光度計，美國GE Nano Vue公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因擴增

細胞色素P450單加氧酶HPO (Hyoscyamusmuticus，GenBank：EF569601.1)、瓦倫西亞烯氧化酶CnVO(Callitropsisnootkatensis，GenBank：JX518290)、CYP450還原酶AtCPR (Arabidopsisthaliana， GenBank：NM_118585.3)，瓦倫西亞烯合成酶CnVS(Callitropsisnootkatensis，GenBank：JX040471)，由上海生工生物工程有限公司經密碼子優化后合成。以公司合成的基因為擴增模板，用引物對HPO-U/D，CnVO-U/D，AtCPR-F/R，VS-U/D分別擴增出HPO，CnVO，AtCPR，CnVS四個基因片段，引入酶切位點SmaI、BamH I。以酵母基因組為模板，ADH1-U/D，tHMG1-U/D為擴增引物對，從酵母基因組擴增得到ADH1和tHMG1，試驗所需引物如表3所示。

1.2.2 表達載體的構建

基于課題組前期構建好的表達載體YEp352-PGAL1-GFP-TCYC1，用BamH I和SmaI雙酶切該載體和經PCR擴增得到的目的基因片段HPO、AtCPR、CnVO，經切膠回收，純化，16 ℃過夜連接。轉化至感受態細胞E.coliDH5中，成功構建3個表達載體。基于YEp352-PGAL1-HPO-TCYC1的成功構建，以YEp352-PGAL1-HPO-TCYC1為模板，GAL1-F1/ GAL1-R1為引物，PCR擴增出具有酶切位點EcoR I和PstI的PGAL1-HPO-TCYC1基因表達盒，然后用EcoR I和PstI對PGAL1-HPO-TCYC1基因片段及YEplac181空載進行雙酶切。純化后連接，構建YEp181-PGAL1-HPO-TCYC1的重組表達載體。同理可以構建YEp181-PGAL1-CnVO-TCYC1的重組表達載體。基于此，利用重疊延伸PCR技術構建了對應的4個突變體，分別為mHPO，CnVO-3，CnVO-4，CnVO-34。

表3 試驗所用引物Table 3 Primers used in this study

注：下劃線部分為酶切位點。

基于課題組前期構建好的表達載體YEp181-PTDH3-TADH1和YEp181-PTEF1-TCYC1，用BamH I和SmaI雙酶切上述兩載體及目的基因片段CnVS，16 ℃過夜連接，分別得到YEp181-PTDH3-VS-TADH1和YEp181-PTEF1-VS-TCYC1重組表達載體。同樣的，得到YEp181-PTDH3-tHMG1-TADH1和YEp181-PTDH3-ADH1-TADH1兩個表達載體。最后利用SalI，XhoI同尾酶的性質，運用biobrick的方法，實現多基因串聯表達在同一表達載體上。

1.2.3 培養方法

將構建好的重組表達載體，利用酵母轉化試劑盒轉入相應的酵母感受態細胞中，得到重組酵母菌株。

靜息細胞試驗細胞培養方法：(1)接種：挑轉化子接種于5 mL SD-(Leu-(Ura液體培養基中，培養22～24 h，OD600為1～3。(2)擴大培養：準備數個滅菌的250 mL的帶擋板的搖瓶。每瓶分裝50 mL SD-ΔLeu-ΔUra，接種種子液，使發酵初始OD600為0.1。30 ℃，200 r/min培養20～22 h，OD600為3.5～4.0。(3)誘導培養：1 060×g離心收集菌體，棄盡上清，50 mL SG-ΔLeu-ΔUra誘導培養基重懸菌體，30 ℃，200 r/min誘導8 h。(4)1 062×g離心，收集150 OD600單位的誘導后細胞，1 mL、50 mmol/L K3PO4溶液(pH 7.4)重懸，裝至催化小瓶，添加20 μL、100 mmol/L瓦倫西亞烯(溶于DMSO且含1%(體積分數) Triton X-100)，蓋子旋松，30 ℃、200 r/min催化 18 h。(5)制樣：加入1 mL乙酸乙酯，室溫條件下用VXR basic Vibrax?最大轉速振蕩30 min、2 720×g離心15 min，待分層后取有機相，500 μL的有機相加入500 μL的乙酸乙酯，再加入2 μL、25 mmol/L的異長葉烯，少量無水硫酸鈉，除去可能存在的水分，用0.22 μm無菌有機相濾頭過濾到干凈的氣相色譜瓶中，-20 ℃保存。

原位發酵培養方法：(1)活化的平板在30 ℃恒溫培養箱培養2～3 d。(2)接種：挑單菌落接種于5 mL的SD-ΔLeu-ΔUra液體培養基中，30 ℃，200 r/min培養22～24 h，OD600長到1～3。(3)將種子液分別接種于含10 mL SD-ΔLeu-ΔUra的50 mL小搖瓶中，每株菌做3個平行，起始OD600為0.05，30 ℃培養14～16 h，OD600長到1。(4)1 062×g離心收集菌體，10 mL SG-ΔLeu-ΔUra重懸，并加入2 mL的正十二烷覆蓋。30 ℃、200 r/min培養48 h。(5)取發酵液上層有機相500 μL，加入500 μL的乙酸乙酯，再加入2 μL、25 mmol/L的異長葉烯作為內標，用0.22 μm無菌有機相濾頭過濾到干凈的氣相色譜瓶中。

補料分批發酵方法：發酵罐條件，通氣量1 vvm，DO>30%，溫度30 ℃，攪拌轉速200～500 r/min，2 mol/L NaOH自動控制pH=5.5。發酵方式為間歇補料發酵，每隔48 h補料1次，每次50 mL、20倍的SG儲液。補料次數3次。

(1)一級種子液培養：從活化的平板上挑取單菌落接種到接種于5 mL的SD-ΔLeu-ΔUra液體培養基中，30 ℃，200 r/min培養22～24 h，OD600長到 1～3。

二級種子液培養：將一級種子液接種到含有50 mL SD-ΔLeu-ΔUra液體培養基的250 mL擋板搖瓶中，使起始OD600為0.1，30 ℃，200 r/min培養24 h，OD600為3～5。

(2)發酵罐接種：超凈工作臺中，用50 mL離心管收集菌體，常溫1 060×g離心收集菌體，棄盡上清，并在超凈工作臺用50 mL SG-ΔLeu-ΔUra重懸菌體。然后接種至裝有950 mL SG-ΔLeu-ΔUra的發酵罐中，起始OD600為0.3～0.5。并覆蓋200 mL的正十二烷，開始發酵。

(3)每隔12 h取1次樣，每次取樣控制在3～5 mL，12 000 r/min離心5 min。取上層有機相制備氣相樣。方法同搖瓶制樣。

1.2.4 GC-FID及GC-MS檢測分析產物

GC-FID：檢測產物用到的是Hewlett-Packard 5890 Ⅱ 氣相色譜儀，色譜柱為5% Ph-Me硅氧烷柱，規格為10 m×0.10 mm×0.10 μm，檢測器為氫火焰檢測器(flame ionization detector，FID)，設置的程序如下：1 μL樣品分流進樣，分流比30∶1，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度320 ℃，流速為0.4 mL/min，柱溫100 ℃保持10 min，再以10℃/min升溫至200 ℃，200 ℃保持8 min，總時間為28 min。打開儀器及軟件，編好序列，將樣品瓶按順序放到樣品盤中，進樣。

GC-MS：本試驗用到的是Hewlett-Packard 5890 Ⅱ 氣相色譜儀，色譜柱為石英毛細管柱，規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm，檢測器為質量選擇檢測器(mass selective detectors，MSD)。程序同GC-FID程序。質量掃描的方式：選擇離子掃描。質譜條件：電子轟擊(EI)電離源，電子能量70 eV。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母重組載體的構建

2.1.1 單基因表達載體的構建

以公司合成的基因為模板，引物對HPO-U/D、CnVO-U/D、AtCPR-F/R、CnVS-U/D分別擴增出具有酶切位點的HPO、CnVO、AtCPR、CnVS四個基因片段，長度分別為1 509、1 512、2 079、1 770 bp。擴增得到的PCR產物經1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳驗證均符合預期大小，結果如圖1所示。

以YEp181-PGAL1-mHPO-TCYC1載體的構建為例，分別以GAL1-F1/HPO-482DM、HPO-482UM/GAL1-R1為擴增引物對，以YEp352-PGAL1-HPO-TCYC1為模板，擴增出上下游2個小的基因片段，大小分別為2 023和376 bp，將純化后的兩片段混合，使其互為模板和引物，然后加入dNTP及引物GAL1-F1/ GAL1-R1進行PCR擴增，得到已經定點突變的全長片段mHPO，長度為 2 364 bp，CnVO-3，CnVO-4和CnVO-34長度均為2 367 bp。然后利用限制性內切酶EcoR I和PstI對該片段及載體YEplac181進行雙酶切，將酶切后的載體與片段連接，得到YEp181-PGAL1-mHPO-TCYC1，同理得到YEp181-PGAL1-CnVO-3-TCYC1，YEp181-PGAL1-CnVO-4-TCYC1， YEp181-PGAL1-CnVO-34-TCYC13個重組表達載體。酶切驗證如圖2所示，大小符合預期，測序結果正確。

M-DL10 000 DNA marker；1-CnVO；2-HPO；3-AtCPR；4-CnVSa-CnVO和HPO的PCR產物；b-AtCPR的PCR產物；c-CnVS的PCR產物圖1 HPO，CnVO，AtCPR，CnVS四個基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis of HPO, CnVO,AtCPR， CnVS four gene fragments

M-DL10 000 DNA Marker；1～3-YEp181-PGAL1-mHPO -TCYC1質粒，質粒單切，質粒雙切；4～6-YEp181-PGAL1-CnVO-3 -TCYC1，質粒單切，質粒雙切；7～9-YEp181-PGAL1-CnVO-4-TCYC1質粒，質粒單切，質粒雙切；10～12-YEp181-PGAL1-CnVO-34 -TCYC1圖2 突變體酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The agarose gel electrophoresis of the mutantsenzyme digestion

用BamH I和SmaI雙酶切YEp181-PTDH3-TADH1和YEp181-PTEF1-TCYC1及擴增得到的CnVS基因片段，連接轉化獲得YEp181-PTDH3-VS-TADH1和YEp181-PTEF1-VS-TCYC1重組表達載體。從NCBI上獲得ADH1，tHMG1基因序列，以試劑盒提取的釀酒酵母PK2-1Ca的基因組為模板，引物對ADH1-U/D， tHMG1-U/D擴增出目的基因片段，經酶切連接轉化，得到YEp181-PTDH3-ADH1-TADH1， YEp181-PTDH3-tHMG1-TADH1，上述載體酶切驗證如圖3所示，切下的目的片段大小分別為1 770，2 492，1 047和1 578 bp，大小符合預期。

M-DL10000 DNA Marker;1～2-YEp181-PTDH3-VS-TADH1質粒，BamH I和Sma I雙酶切；3～4 YEp181-PTEF1-VS -TCYC1質粒，EcoR I和Pst I雙酶切；5～6-YEp181-PTDH3- ADH1-TADH1質粒，BamH I和Sma I雙酶切；7～9-YEp181-PTDH3- tHMG1-TADH1質粒；8～10-YEp181-PTDH3- tHMG1-TADH1質粒BamH I和Sma I雙酶切a-YEp181-PIDH3-VS-TADH1質粒；b-YEp181-PTEF1-VS-TCYC1質粒；c-YEP181-PTDH3-ADH-TADH1質粒；d-YEP181-PTDH3-tHMG1-TAOH1質粒圖3 質粒酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 The agarose gel electrophoresis of plasmids enzyme digestion

2.1.2 多基因串聯表達載體的構建

考慮到圓柚酮生物合成途徑涉及的關鍵酶基因較多，本研究將多個基因串聯表達在同一表達載體上，得到p181-V1H，p181-V2H，p181-V1V2，p181-V1HV2， p352-A1mHC 5個多基因重組表達載體。部分載體酶切驗證結果如圖4所示。

M-DL15000 DNA Marker;1、3-p352-A1mHC質粒；2、4-酶切(1 953、2 322、8 043bp)； 5～7-p181-V1HV2原質粒，單切(13 498 bp)，雙切(2 661、10 837 bp)a-p552-AlmHC質粒；b-P181-V1HV2質粒圖4 p352-A1mHC質粒和p181-V1HV2質粒酶切驗證瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 The agarose gel electrophoresis of enzyme digestionof p352-A1mHC and p181-V1HV2

2.2 CYP450的篩選

各重組菌株靜息催化瓦倫西亞烯生成圓柚醇和圓柚酮的產量如圖5所示。對照菌株PK2-C中沒有檢測到圓柚醇和圓柚酮。PK2-01檢測到48.36 mg/L的圓柚醇和10.93 mg/L的圓柚酮，該菌株對底物瓦倫西亞烯的轉化率可達10.73%。而之前報道稱HPO不能在釀酒酵母細胞中轉化瓦倫西亞烯生成圓柚酮[14]。故推測S.cerevisiaePK2-1Ca體內存在脫氫酶將中間產物圓柚醇轉化生成了圓柚酮。顯然，PK2-02中圓柚醇和圓柚酮的產量與PK2-01相比，沒有明顯的差別。之前文獻報道突變體mHPO對瓦倫西亞烯的轉化率提高了15倍[14]，然而這是基于體外檢測的結果。本試驗的結果表明，在非生理條件下獲得的酶動力學數據通常不符合代謝途徑中體內酶動力學。如今開發了許多基于模擬各種生物細胞體內的條件測定酶動力學的方法[15]。此外對于CnVO及其對應的3個突變體(CnVO A366P/L377V、CnVO K477L/Y478V/V481T/L482I、CnVO A366P/L377V/K477L/Y478V/V481T/L482I)而言，圓柚醇和圓柚酮的產量較mHPO下降了10%～15%。故根據上述試驗結果，選取mHPO作為后續試驗的基礎。

圖5 不同菌株靜息細胞試驗圓柚醇和圓柚酮的產量Fig.5 The yield of β-nootkatol and (+)-nootkatonein resting cell assays of different strains

2.3 重組酵母菌株產物產量分析

基于靜息細胞試驗篩選得到的P450氧化酶mHPO，構建了多株圓柚酮從頭合成的重組酵母菌株。代謝途徑如圖6所示。

圖6 釀酒酵母中圓柚酮的生物合成途徑Fig.6 The biosynthetic pathway of (+)-nootkatone in Saccharomyces cerevisiae

取各菌株發酵液的上層有機相制樣，經GC-FID檢測，各菌株產量如圖7所示。(1)當宿主菌株為PK2-1Ca-M時，總萜產量相較于宿主菌株為野生型菌株PK2-1Ca時的2.79 mg/L，提高了3.92倍。故下調ERG9和敲除ROX1能夠有效減少支流，促進法尼烯焦磷酸鹽FPP的積累[16-18]，從而增加瓦倫西亞烯和圓柚醇的產量。有文獻報道，當宿主菌株為WAT11時，總萜產量僅為1.11 mg/L[19]，研究表明，在釀酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK的菌株中，麥角固醇生物合成途徑強于其他來源的菌株[20]，比如S288c，這可能使得S.cerevisiaeCEN.PK菌株體內法尼烯焦磷酸鹽FPP的濃度比一般菌株要高，故總萜產量提高。(2)進一步過表達tHMG1，總萜產量提高了1.7倍，表明tHMG1在類異戊二烯合成途徑中的關鍵地位[21-28]。(3)當CnVS的啟動子由TDH3更換為TEF1時，總萜產量整體提高了2倍，達34.4 mg/L。說明啟動子的適配性對目標產物的產量起著至關重要的作用[29-30]，具體影響機制有待進一步研究。(4)增加CnVS的拷貝數時，PK2-26總萜產量顯著下降至13.4 mg/L，即意味著增加CnVS的拷貝數不一定能增加產物瓦倫西亞烯的積累，曾有文獻報道目的基因的拷貝數與目標產物的產量不一定呈正相關關系，即不是某目的基因拷貝數越高，相應的產物產量越高[31-32]，LIAN等發現，當使用基于CEN/ARS的低拷貝數質粒時，纖維二糖利用途徑表現出比高拷貝數質粒高得多的效率[33]。

圖7 不同酵母工程菌株體內合成瓦倫西亞烯及圓柚醇的產量Fig.7 The yield of (+)-valencene and β-nootkatolin vivo with different strains注：第一個“+、-”代表erg 9-rox為“+、-”；第二個“+、-”代表t HMG為“+、-”。

2.4 重組酵母菌株3L發酵罐發酵生產瓦倫西亞烯及其衍生物

根據搖瓶水平的結果，選定最佳組合菌株PK2-24，按照1.2.3中的方法，進行上罐發酵試驗，希望進一步提高總萜的產量。如圖8，在發酵的早期，消耗的半乳糖主要用于菌體的生長，瓦倫西亞烯和圓柚醇的積累比較緩慢，保持在較低的水平。48 h后，菌體生長進入平臺期，但是產物的積累量仍不斷提高，發酵158 h后，瓦倫西亞烯和圓柚醇的積累量分別達到264.6和46.3 mg/L。終OD600為6.8。可見重組酵母PK2-24生產總萜的能力(45.9 mg/L)是文獻報道中畢赤酵母總萜的生產能力(0.7 mg/L)的65.6倍[7]。且是目前文獻報道的釀酒酵母的最高產量(表4)，說明該菌株已具備一定的生產優勢。

圖8 3L發酵罐中PK2-24菌株瓦倫西亞烯和圓柚醇的積累及菌株的生長曲線Fig.8 The production of (+)-valencene and β-nootkanoland the growth curve of PK2-24 in a 3L fermentor

表4 釀酒酵母合成瓦倫西亞烯及其衍生物的比較Table 4 Comparison of (+)-valencene and its related terpenoids production by recombinant Saccharomyces cerevisiae

注：a，來源于黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶；b，來源于擬南芥的細胞色素還原酶；c，從文獻中的圖片計算得到。

綜上，重組酵母PK2-24上罐發酵過程中始終有大量的瓦倫西亞烯的積累，表明HPO和AtCPR的活性不足以將瓦倫西亞烯充分轉化。無論是搖瓶水平還是發酵罐水平，工程菌株的終OD600始終保持在 6.0～9.0的水平，菌體生物量偏低。遺憾的是，始終都沒有檢測到圓柚酮的生成，這與靜息細胞試驗不相符。其一可能是全細胞培養過程中，細胞內的其他代謝途徑比較活躍，競爭中間體圓柚醇生成了其他副產物；其二可能由于有機相的覆蓋，瓦倫西亞烯和圓柚醇被過早萃取至上層有機相，阻礙底物進出細胞，無法與酵母體內的酶充分接觸；其三，生成的少量圓柚酮部分積累在細胞內膜上[35]，沒有充分釋放到細胞外，故培養液中沒有檢測到圓柚酮。

3 結論

目前，利用微生物合成瓦倫西亞烯及其衍生物已見諸報道[7, 9, 11]，但仍然面臨著許多挑戰，包括產量低，周期長，分離純化困難等問題[36]。而釀酒酵母作為公認的食品安全微生物，具有其獨特的優勢。本文以釀酒酵母PK2-1Ca為宿主菌株，引入來源于植物的HPO、CnVO、CnVS及AtCPR，重構瓦倫西亞烯及其衍生物的生物合成途徑。結合代謝工程策略，最終獲得瓦倫西亞烯及其相關衍生物的高產重組酵母菌株，PK2-24，經3L發酵罐上進行補料分批發酵，瓦倫西亞烯及圓柚醇的產量分別達264.6和46.3 mg/L，為目前文獻報道的最高產量，展現了釀酒酵母生產倍半萜類物質的應用前景。值得注意的是，試驗中有大量的瓦倫西亞烯的積累，表明HPO和AtCPR的活性不足，與文獻報道一致[13]，故后續研究工作需進一步提高HPO和AtCPR的表達量及其穩定性或者挖掘更高效的CYP450，使瓦倫西亞烯充分轉化。此外，還需提高菌體生長密度，促進產物積累及挖掘具有潛在應用價值的醇脫氫酶，最終獲得終產物圓柚酮，為未來利用重組釀酒酵母規模化生產圓柚酮奠定基礎。