基于SSR熒光標記進行酒花品種鑒定

張志軍,邢磊，岳杰，劉佳，尹花

(啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，青島啤酒股份有限公司，山東 青島, 266100)

酒花(HumlnusLupulus)為大麻科葎草屬多年生蔓性草本植物，雌雄異株，雌花是啤酒釀造重要的組成成分。酒花被譽為“啤酒釀造的靈魂”，不僅賦予啤酒爽口的苦味和獨特的酒花香氣，還有穩定泡沫、防腐和提高非生物穩定性的作用。不同品種酒花在樹脂、酒花油成分上差異較大，直接影響啤酒的風味和口感[1]。因此在酒花品種的選育、種植、加工、使用過程中，品種真實性鑒定對于酒花種植者、經銷商和啤酒企業而言都是至關重要的判定指標。

經過多年的發展，酒花品種鑒定主要包括形態鑒別法、化學成分分析法和DNA分子標記法。傳統的酒花形態鑒別主要是基于酒花種植的農學特征、酒花球果形態來識別酒花品種，而酒花采摘后經烘干、粉碎、制粒加工，已經無法區分形態特征。化學分析法是將酒花苦味酸[2]，精油成分[3-5]或其他酒花成分等[6]作為品種區分的依據，但化學成分易受種植和貯藏條件等因素的影響[7-8]。DNA分子標記不受土壤、氣候和貯運等因素的影響，但已報道的隨機擴增多態性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)[9-10]和擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)[11]2種方法，具有標記顯性遺傳和重復性低等缺點[12-13]。微衛星(simple sequence repeats，SSR)作為第二代分子標記，具有多態性豐富、共顯性遺傳和擴增模式簡單等特征[14]，已成為大麥[15-17]、小麥[18-19]等農作物品種鑒定的主要方法，在酒花品種鑒定上也有研究報道[20-21]。PATZAK等[20]基于聚丙烯酰胺凝膠電泳，利用30對SSR引物對11個酒花品種進行鑒定；HORREO等[21]利用毛細管電泳對生長在西班牙西北部(加利西亞)的野生啤酒花進行遺傳多樣性分析。目前SSR分子標記主要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳2種檢測平臺，由于毛細管電泳具有高效、快速、微量、自動化等優點，已成為SSR分子標記的主流檢測平臺。然而毛細管電泳檢測時要求擴增片段標記熒光染料，尤其在引物篩選階段，如果對上百對引物進行熒光標記則引物成本較高，影響實際應用。TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)分子標記法作為一種低成本分析技術，在正向引物5′端標記M13尾巴序列，僅對M13通用引物進行熒光標記，引物合成成本大幅降低。該技術目前已在蘋果、玉米、枸杞等農作物的種質資源多樣性研究方面進行了廣泛的報道[22-27]，但在酒花品種鑒定方面尚無相關的研究報道。

本研究基于SSR熒光標記結合毛細管電泳，從大量引物篩選中選擇多態性豐富的引物用于酒花品種指紋圖譜構建，目的是建立一種快速、準確的酒花品種真實性鑒定技術，為酒花在種植、加工、采購環節提供品種區分和品種產權保護方面的技術支持，從源頭上保障酒花產品的質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青島大花、Hersbruker、Saaz、Cascade等18個酒花品種共126個樣品由啤酒生物發酵工程國家重點實驗室收集，品種及產地見表1。為保證品種純度的可靠性，上述酒花品種主要收集單株酒花的球果和葉片樣品。待測樣品為3個酒花公司送檢的5份Cascade商業酒花樣品(顆粒酒花)，分別標記為T1～T5，進行品種真實性鑒定。

TaqDNA聚合酶，美國Sigma-Aldrich公司；dNTPs，美國Thermo Scientific公司；GeXP遺傳分析系統試劑，美國Sciex公司；植物DNA提取試劑盒，北京百泰克公司；熒光引物，北京英駿生物技術有限公司合成。

表1 酒花品種及產地Table 1 Hop varieties and origin

1.2 儀器與設備

96通道高通量核酸提取儀，北京百泰克公司；C1000 TouchTMPCR儀，美國Bio-Rad公司；GenomeLabTMGeXP遺傳分析系統，美國Sciex公司；CK1000D高通量組織研磨儀，北京托摩根公司；5430型離心機，德國Eppendorf公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

稱取30 mg酒花球果樣品，置于2.0 mL離心管中，加一顆5 mm鋼珠，利用高通量組織研磨儀1100 r/min粉碎1 min。按照植物DNA提取試劑盒步驟進行DNA提取，利用Nano Drop 2000對DNA濃度與純度進行檢測。提取的DNA統一稀釋到20 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.3.2 引物篩選

根據相關報道[28-31]，選擇103對SSR引物作為本研究的候選引物進行多態性引物篩選。正向引物的5'端與M13序列相連合成TP-M13正向引物，M13通用引物在5′端用Alexa Fluor 750熒光進行標記，引物序列TGTAAAACGACGGCCAGT，反向引物為正常引物。

1.3.3 PCR擴增

PCR反應體系：2 μL 10×PCR Buffer，3 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 2 mmol/L dNTP，0.4 U Taq DNA聚合酶，1 μL 0.8 μmol/L正向引物，1 μL 3.2 μmol/L反向引物，1 μL 3.2 μmol/L M13通用引物，1 μL 20 ng/μL模板DNA，滅菌去離子水補足到20 μL。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 毛細管電泳檢測取

0.5 μL分子質量內標加入39.5 μL甲酰胺緩沖液，混合均勻，加入樣品板中。取1 μL稀釋后的PCR產物加入上樣板中，石蠟油覆蓋防止揮發，緩沖液板中添加3/4體積分離緩沖液。毛細管電泳進樣電壓2.0 kV，時間30 s，90 ℃變性2 min，分離電壓6.0 kV，分離時間35 min。

1.4 數據分析

PCR產物分離過程中，GeXP遺傳分析系統利用GeneMapper-V3.0軟件對擴增產物的熒光信號強度進行收集、儲存，參照分子質量內標得到圖譜中各片段的大小。通過人工分析將電泳圖譜中的特征峰判讀為對應的等位基因，取3次重復的平均值并四舍五入取整數，作為該品種的等位基因大小。電泳圖譜中的單峰(純合型)用X表示，雙峰(雜合型)的主峰和次峰用X/Y表示，根據各品種等位基因大小進行品種DNA指紋數據分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選及多態性分析

利用18個酒花品種進行引物篩選，每個品種選擇3個代表性樣品，綜合考慮等位基因數量、峰值特征情況，從103對候選引物中篩選到11對多態性豐富的SSR引物，引物序列信息見表2。

表2 引物序列信息Table 2 Information of primer sequences

11對引物在18個酒花品種上共檢測到69個等位基因，每對引物的等位基因數量3～11個不等，平均每對引物擴增出6.3個等位基因。引物HlGT1多態性最豐富，含有11個等位基因；引物HlGA4多態性最低，含有3個等位基因。通常情況下引物擴增產物的等位基因越多，則該引物的品種區分能力越大。此外，引物等位基因數量與可直接區分品種的數量也有一定關系，引物HlGT1含有的11個等位基因可單獨區分8個酒花品種，如Saaz、Perle、Hallertauer、Magunum、Nugget、Columbus、Northern Brewer和麒麟豐綠；而引物HLC-001D含有5個等位基因，只能區分麒麟豐綠一個品種；引物HlGA4含有3個等位基因，無法區分任何一個品種。因此僅靠一對引物難以區分全部酒花品種，只有通過引物間的相互組合才能實現可區分品種數量的最大化。引物HlGT1可單獨區分8個品種，其與引物3a88組合后，二者可區分品種增加到14個，在18個品種中區分率達到82.3%，在全部兩對引物的組合中HlGT1和3a88組合的鑒定效率最高。相比較而言，引物HLC-001D和HlGA4組合后只能區分5個品種，區分率僅29.4%。通過最優引物組合設計，在引物3a88和HlGT1組合的基礎上增加HLC-001D和HlGA4后可實現全部18個酒花品種的區分，區分率100%。因此將引物3a88、HlGT1、HLC-001D和HlGA4作為酒花品種鑒定的核心引物，其他7對引物作為擴展引物用于輔助驗證提高鑒定的準確性。

DNA指紋圖譜是指某一品種的特異性DNA片段(特征峰)，按照固定的引物順序排列后構成的該品種特有的譜圖。利用篩選的4對核心引物(3a88、HlGT1、HLC-001D和HlGA4)對18個品種的126個酒花樣品進行指紋圖譜分析，并對所有供試樣品的品種真實性進行判定。圖1為國產青島大花在4對引物下的指紋圖譜，圖2為捷克Saaz香花的指紋圖譜。引物HLC-001D的毛細管電泳圖譜中青島大花的特征峰為213 bp，Saaz香花為196/213 bp；引物3a88的電泳圖譜中青島大花的特征峰為249/259 bp，Saaz香花為247 bp；引物HlGT1的圖譜中青島大花特征峰為177/203 bp，Saaz香花為195 bp。引物HlGA4的圖譜中青島大花為281 bp，Saaz香花為279 bp。結果表明，4對引物擴增片段范圍均勻分布在150～300 bp，各引物特征峰明顯，非特異性峰較少，適合種指紋圖譜分析。

圖1 青島大花的指紋圖譜Fig.1 The fingerprint of Tsingtao flower

圖2 Saaz的指紋圖譜Fig.2 The fingerprint of Saaz

2.2 酒花品種指紋數據庫構建與驗證

利用4對核心引物對18個品種的酒花樣品進行分析，在已構建酒花品種指紋圖譜的基礎上，將單一品種的指紋數據按特定的引物順序進行排列，匯總后得到各酒花品種的指紋數據庫，見表3。

由表3可知，不同品種酒花的指紋數據差異大小不等，某些品種的指紋數據差別較大，如青島大花的特征指紋數據為213、249/259、177/203、281 bp，麒麟豐綠為202、251、174/197、283 bp，2個品種在4對引物上差異明顯，使用任何一對引物都能加以區分。而某些品種的指紋數據比較接近，只在個別等位基因上有差異，需要多引物組合后才能區分，如德國酒花Hallertauer、Hersbruker和Tradition。引物多態性分析表明，4對核心引物在18個酒花品種上共擴增出28個等位基因，每對引物的等位基因數量3～11個不等，平均等位基因數量為7.0個。其中引物HlGT1多態性最豐富，在159～203 bp包括11個等位基因；引物3a88多態性其次，在239～259 bp有9個等位基因；引物HlGA4多態性最低，在279～283 bp僅有3個等位基因。

表3 酒花品種指紋數據庫 單位：bp

在對未知酒花樣品進行品種鑒定時，通過DNA提取、PCR擴增和毛細管電泳分離、圖譜分析后得到樣品指紋數據，將其與目標酒花品種的標準指紋數據比對即可確定所屬品種，實現品種真實性鑒定。以3個商業酒花公司提供的5份Cascade樣品鑒定為例，常規指標分析表明5份樣品的甲酸和酒花油含量差異較大，因此廠家對品種的真實性存疑。鑒定結果表明，樣品T1～T5在核心引物(HLC-001D、3a88、HlGT1、 HlGA4)下的指紋數據與對照Cascade酒花的標準指紋數據完全一致，說明5份樣品均為Cascade，樣品來源真實可靠。研究過程中發現，建庫收集的個別酒花樣品的指紋數據與所標識的品種名稱并不一致，可能是由于樣品在種植、取樣、運輸過程中出現信息錯誤導致的。

基于最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構建原則[10]，在品種數量一定的情況下，需對大量引物進行片段分析和多態性驗證，篩選的引物數量越少則鑒定效率越高，因此核心引物篩選是整個品種鑒定的關鍵。首先，引物篩選的基本原則在于選擇等位基因數量多的引物。其次，對不同引物的區分能力進行排列組合，優選數量最少、擴增穩定的引物為核心引物。最后，將多引物整合在多重PCR反應體系中，擴增片段通過標記不同顏色熒光和片段大小進行區分，從而縮短檢測時間、降低成本。該數據庫具有擴展性，今后的研究需要豐富國內及全球的酒花品種，新品種的納入可不斷擴大數據庫的鑒定能力，通過構建多重PCR反應體系，進一步提高檢測效率。

3 結論

本研究基于TP-M13-SSR熒光標記結合毛細管電泳技術，從103對候選引物中篩選得到11對多態性豐富、重復性好的引物，通過引物組合設計，確定了4對核心引物構建的18個國內外主要酒花品種指紋數據庫，共檢測到28個等位基因，各引物等位基因數量3～11個不等，每對引物平均產生7.0個等位基因。酒花品種指紋數據的構建及其品種真實性鑒定，在酒花品種選育、田間種植、新品種產權保護等方面具有重要的應用價值，為酒花種植者、生產者、啤酒企業提高品種選育、田間管理和品質評價能力提供了技術支持。