納豆多糖的理化性質及結構分析

楊文麗，楊波，楊光

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海, 200093)

納豆中含有豐富的營養物質，也具有較高的藥用價值，不僅氨基酸組成與液態奶類似[1]，其中含有的低聚糖和粗多糖對腫瘤、肝炎、心血管、抗衰老等也有獨特的生物活性。多糖特殊的生物活性源自于其復雜的空間結構，例如糖醛酸是體現多糖活性的重要部分[2]，也是構成肝素、硫酸軟骨素、透明質酸等高活性物質的成分；而硫酸根含量不同的多糖其抗病毒和抗凝活性也有區別[3]。近年來關于納豆的研究主要集中在納豆激酶等蛋白質方面，而納豆多糖的抗氧化、改善免疫學機制以及提高免疫力的作用雖然已經被證實[4-6]，但其組成成分及分子結構卻尚未被研究。即使多糖具有較高的生理活性及功能作用，若沒有對其結構、作用機理及毒理作用進行探究，便不能被加工利用。本研究對納豆中提取的納豆多糖的結構類型進行分析，既可以避免納豆的不良風味，還能保留其對人體有益的功能性成分，旨在為制作保健品或藥品原料的篩選供給多種結構類型的化合物，也為植物多糖的進一步開發利用提供一定的實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

納豆多糖：本實驗室提取[4]；

NH4HCO3、CuSO4、K2SO4，國藥化學試劑有限公司；咔唑，上海展云化工有限公司；半乳糖醛酸、三氯乙酸，國藥化學試劑有限公司；BaCl2、甲醇，宜興市第化學試劑廠；Sephadex G-75凝膠，上海維塔；KBr(光譜純)，天津天光光學儀器有限公司；剛果紅,Macklin；HCl、四硼酸鈉、明膠等,均為分析純。

1.2 儀器

WFJ 7200可見分光光度計,優尼柯儀器有限公司；KDN-1凱氏定氮儀,上海雷磁創益儀器儀表有限公司；DHG-9203A鼓風干燥機,上海一恒科學儀器有限公司；Waters 2659高效液相凝膠色譜儀,ThermFisher；LCQDECAXPMAX型質譜儀,美國Thermo Finigan；I3X酶標儀,美谷分子儀器有限公司；NICOLET5700紅外光譜儀,美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 總糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[7]。

1.3.2 蛋白質含量測定

采用凱氏定氮法[8]。

1.3.3 糖醛酸含量測定

參照趙鶴鵬等[9]的方法：

標準曲線制作：分別取質量濃度為1×10-4g/L的半乳糖醛酸溶液(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL)加入洗凈并烘干的試管中，補蒸餾水至1 mL。將各試管在冰水浴中加入四硼酸鈉-硫酸溶液(0.717 g四硼酸鈉溶解于150 mL濃H2SO4)5 mL，搖勻，沸水浴10 min，冷卻后加入0.2 mL的0.15%的咔唑溶液，繼續沸水浴10 min并冷卻，在最大吸收波長處測定吸光度值，以半乳糖醛酸濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標繪制標準曲線。樣品測定同標曲。

最大吸收波長的確定：以上述不加半乳糖醛酸溶液的試管做空白，并利用加入0.5 mL半乳糖醛酸溶液的試管在340～700 nm進行紫外掃描，繪制其吸光度值曲線，其中吸光度值最大者為糖醛酸的最大吸收波長。

標準曲線繪制[11]：分別取不同體積的K2SO4-HCl溶液于試管中，并補充HCl溶液至200 μL。向各試管中加入3.8 mL 30 g/L的三氯乙酸溶液及1 mL氯化鋇-明膠溶液。搖勻后靜置15～20 min，在360 nm處測定吸光值。對照組中為明膠溶液替換為氯化鋇-明膠溶液。以K2SO4質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 納豆多糖的凝膠過濾層析

通過改良王龍艷[12]的層析方法，采用Sephadex G-75凝膠層析柱(1.5 cm×90 cm)對納豆多糖進行分離純化。連接蠕動泵和收集器，將凝膠進行溶脹、裝柱、平衡24 h，以0.2 mol/L NH4HCO3為洗脫液[13]，納豆多糖濃度為10 g/L，經0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣。洗脫條件為上樣體積5 mL，流速0.3 mL/min，每10 min收集1管。洗脫結束后，將收集到的多糖溶液進行濃縮、透析、凍干可得純品納豆多糖。

1.3.6 納豆多糖分子質量的測定

采用高效液相色譜法[14]測定納豆多糖的重均分子量，檢測器為示差折光儀。不同分子質量的右旋糖酐(5.3、9.8、13.1、36.8、64.7 kDa)為標準品，以保留時間為橫坐標，以lgMw為縱坐標,繪制標準曲線[15]。

色譜條件：Shodex OHpak SB-804HQ色譜柱；以0.1 mol/L NaNO3，含0.03% NaN3溶液為流動相，樣品濃度為1 g/L；流速為0.5 mL/min，進樣量20 μL，檢測時間為60 min，柱溫為室溫。

1.3.7 單糖組成的測定

采用氣-質聯用色譜法檢測納豆多糖單糖組成。

多糖的水解[16]：精密稱取納豆多糖0.003 0 g置于梨形瓶中，加入0.7 mL蒸餾水和0.3 mL TFA溶液，密封梨形瓶口并劇烈振蕩使溶液充分混勻，120 ℃下水解6 h，冷卻后加入1 mL甲醇在60 ℃下減壓旋干，并反復3次。

水解物的衍生：向水解后的樣品中加入30 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，振蕩溶解后90 ℃氧化30 min，冷卻后再加入1 mL乙酸酐，再次90 ℃氧化30 min。向溶液中加入1 mL的二氯甲烷和3 mL蒸餾水并劇烈振蕩。離心分層除去上層水相，反復3次。除去溶液中水分，吸取上層清液，過0.22 μm有機濾膜后待測。以7種純品單糖作為對照。

1.3.8 紅外光譜

參考馬小雙等[17]的測定方法，取2 mg納豆多糖樣品及200 mg干燥的KBr放入瑪瑙研缽中，在高溫干燥條件下將其混勻并研細。將混合物壓成0.3～0.5 mm的透明薄片，在400～4 000 cm-1紅外波長范圍內進行掃描，觀察并分析譜峰情況。

1.3.9 剛果紅實驗

采用改良后曾婷等[18]的實驗方法，稱取納豆多糖樣品20 mg于試管中，再加入1 mL蒸餾水和80 μmol/L剛果紅溶液1 mL，充分混勻后加入NaOH，使各管中NaOH終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，并用紫外全波段掃描，記錄在不同NaOH濃度下的最大吸收波長。

2 結果與分析

2.1 納豆多糖理化性質的分析

2.1.1 總糖

以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度值(490 nm)為縱坐標回執標準曲線，所得回歸方程為Y=5.009 8X+0.016 3，且相關系數R2=0.998 8，表明葡萄糖含量與其吸光度值有良好的線性關系，可用于納豆多糖樣品總糖含量的計算。納豆多糖溶液所得吸光度值平均值為0.347，代入回歸方程并計算得納豆多糖總糖含量約為66.01%。李宏睿等[19]利用超聲波輔助提取大豆多糖，所提取的大豆多糖純度為96.58%，與此相比較，實驗所得納豆總糖的含量較低，原因可能是超聲波的空化作用及高振動頻率會加速植物多糖的溶出以及蛋白質結構的伸展，提高了蛋白質的去除率及大豆多糖的提取率；另一方面是因為發酵過程中納豆菌的生長繁殖對總糖的消耗，降低了納豆多糖的含量。

2.1.2 蛋白質含量

稱取納豆多糖樣品1.00 g，經消化和蒸餾后，滴定消耗0.1 mol/L HCl體積的平均值為1.67 mL，計算得蛋白質含量為1.12%。

2.1.3 糖醛酸含量

半乳糖醛酸與咔唑試劑在H2SO4中的反應物呈紫紅色，顏色深淺與半乳糖醛酸的含量成正比，可通過紫外分光光度計進行比色定量。用不同的儀器與試劑測定半乳糖醛酸時，可能會導致最大吸光值的不同。由圖1可知，咔唑-硫酸法檢測半乳糖醛酸吸光度值的最大波長為510 nm。以半乳糖醛酸濃度為橫坐標，吸光度值(510 nm)為縱坐標進行線性回歸，所得回歸方程為Y=4.926 4X-0.007 7，且相關系數R2=0.998 8。納豆多糖樣品經平行測定得吸光度值平均值為0.451，計算納豆多糖中糖醛酸的含量約為2.79%。夏永剛等[20]探究麻黃多糖中的糖醛酸含量時發現，咔唑-硫酸法操作簡便、靈敏度高，可用于多糖的構效關系和生物學活性研究。

圖1 半乳糖醛酸標準品最大吸收波長測定曲線Fig.1 The maximum absorption wavelength ofGalacturonic acid standard

不同濃度梯度的半乳糖醛酸所測得標準曲線如圖3所示。

2.2 納豆多糖的純化

納豆多糖經緩沖液的溶解后進入層析柱，在流動相0.2 mol/L NH4HCO3的帶動下根據分子質量的大小依次流出色譜柱來進行分級分離。洗脫液經收集器收集后，用苯酚-硫酸法檢測其吸光度值，并繪出洗脫曲線。當洗脫曲線峰形較好且對稱時，說明多糖經洗脫分離后純度較高。由圖2可知，納豆多糖在凝膠柱的分離中呈現一個較對稱的峰，說明納豆多糖為單組分。收集出峰管中的多糖溶液進行濃縮、透析、凍干，可得純品納豆多糖。石浩等[24]用DEAE-纖維素對水溶性大豆多糖進行梯度洗脫，得出水溶性大豆多糖有3個主要組分，說明大豆多糖中較大分子的糖類經納豆菌發酵后成為了分子質量較小且單一的組分。采用Sephadex G-75凝膠柱純化的納豆多糖洗脫曲線如圖2所示。

圖2 納豆多糖在Sephadex G-75凝膠柱上的洗脫曲線Fig.2 The elution curve of natto polysaccharideson Sephadex G-75 column

2.3 納豆多糖的分子質量分析

根據凝膠色譜柱的尺寸排阻特性，多糖經色譜柱洗脫時的保留時間與分子質量的對數呈負相關。用已知分子質量的標準多糖在合適的色譜條件下測出對應的保留時間，并做出其與分子質量對數的標準曲線，在相同條件下測出多糖的保留時間，則可根據標準曲線計算出多糖的分子質量。右旋糖酐標準曲線方程為Y=-0.025 42X+12.836，且相關系數為R2=0.993 5，保留時間與分子質量對數有良好的對應關系。由圖3可知，納豆多糖檢測到了3個對稱峰，中間是一個很好的對稱峰形，保留時間為34.516 7 min。主峰前后2個峰形強度較弱，說明2種分子質量的多糖濃度較低。根據標準曲線方程，代入納豆多糖的保留時間計算得納豆多糖主要組分分子質量量為11.53 kDa。何喜珍等[25]在對大豆多糖不同的降解條件下得到分子質量在21～550 kDa的大豆多糖，納豆多糖組分單一且分子質量較小，是因為納豆菌在發酵過程中對大豆多糖的分解轉化，使多糖部分糖苷鍵斷裂，發生降解，導致分子質量變小。

在相同條件下，納豆多糖所測得的保留時間曲線如圖3所示。

圖3 納豆多糖的保留時間曲線Fig.3 Retention time curve of natto polysaccharide

2.4 單糖組成分析

氣相色譜法可以對化合物進行有效的定性分析，但不適用于復雜的有機物，而質譜法可以對有機化合物進行定量分析，兩者結合則能對復雜有機化合物進行高效的定量和定性分析。單糖標準品圖譜如圖4所示，納豆多糖單糖組成的氣-質聯用色譜分析圖見圖5。由圖5可知，納豆多糖中單糖已完全分開。相比于標準品圖譜，納豆多糖中已知單糖為巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，編號為h的單糖出峰時間在木糖與甘露糖之間，為木糖醇[26]，各單糖摩爾比為巖藻糖∶木糖醇∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.04∶ 1.53∶ 1.57∶ 1.19∶ 4.68。賴富饒等[27]采用糖醇乙酸酯衍生法測定豆皮多糖和豆渣多糖的單糖組成發現，豆皮多糖以甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖為主，豆渣多糖以半乳糖和阿拉伯糖為主，其他種類的單糖皆有，但含量較低。由此可知，納豆菌可能會作用于單糖官能團，使其結構改變。

a-鼠李糖；b-巖藻糖；c-阿拉伯糖；d-木糖；e-甘露糖；f-葡萄糖；g-半乳糖圖4 單糖標準品色譜圖Fig.4 The GC-MS chromatogram of monosaccharide standard

圖5 納豆多糖中單糖組成色譜圖Fig.5 Chromatogram of monosaccharide compositionin natto polysaccharide

2.5 紅外光譜分析

圖6 納豆多糖紅外光譜圖Fig.6 IR speetra of the natto polysaeeharid

2.6 空間結構的分析

剛果紅是一種生物染色劑，能夠與多糖中的單股螺旋結構結合，結合成的復合物的最大吸收波長將隨著單股螺旋結構濃度的升高而變大。在一定的堿性體系中，多糖中的三股螺旋結構發生解聚，使單股螺旋結構的濃度增大，反應溶液的最大吸收波長也會發生變化[29]。由圖7可知，相比于剛果紅本身平緩的變化趨勢而言，納豆多糖絡合物的最大吸收波長隨著NaOH濃度的增大而降低，并且在NaOH濃度為0.3 mol/L時急劇下降，說明納豆多糖中的單股螺旋結構增多，與剛果紅形成的絡合物的最大吸收波長的特殊變化證明納豆多糖具有三股螺旋結構。

圖7 納豆多糖與剛果紅混合堿溶液最大吸收波長的變化Fig.7 Changes in absorption wavelength maximum of mixtureof Congo red and natto polysaeeharid

3 結論