基于納米抗體的酶聯免疫吸附法檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素B

郭鵬利,路云龍,李想,李麗華,任孝茹,陳利莉,張敢為,季艷偉

(西北農林科技大學，陜西 楊凌，712100)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 是一種常見的食源性致病菌，由其引起的食物中毒在革蘭氏陽性菌中高居首位，其致病能力主要取決于該菌產生的腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)[1]。SEs是由S.aureus分泌產生的一類結構相似的可溶性胞外毒素蛋白質，分子質量為 27.5～30 kDa，熱穩定性好，經 100 ℃煮沸 30 min而不被破壞，因此，經S.aureus污染的食物經過一般加熱處理后，雖然細菌菌體可被殺死，但其產生的SEs仍然具有活性和致病力[2-3]。SEs按血清學分類，主要有SEA、SEB、SECs、SED、SEE等血清型，其中SEB因對免疫細胞有嚴重的毒性作用，半致死劑量僅為 20 ng/kg，因此被認定為Ⅱ類毒物，并且易以噴霧的形式用作生化武器[4]。SEB主要存在于肉類、乳及乳制品等蛋白質含量較高的動物性食品中，鑒于此，建立一種簡單、快速、準確、靈敏且低成本的SEB檢測技術顯得尤為重要。

目前，檢測SEB的方法主要有分子生物學檢測法、免疫學檢測法以及生物傳感器法，其中，分子生物學檢測法主要是對SEB的基因進行檢測，但并不能直接檢測蛋白本身[5-8]。基于抗原抗體特異性識別的免疫學檢測技術是實現復雜食品基質中SEB定量檢測的常用技術，酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 是其中一種相對較為成熟的檢測方法，國內外已經有很多的相關研究報道，但是真正商業化的產品并不多[9-10]。目前的ELISA方法多采用多克隆抗體或單克隆抗體作為識別元件，但傳統單克隆抗體存在制備耗時耗力、產量低、以及由于金黃色葡萄球菌表面存在或分泌的金黃色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A，SpA) 會與單克隆抗體的Fc端高親和力結合而產生假陽性結果等問題，進而阻礙ELISA方法的應用[11-12]。近年來，基因工程抗體得到了蓬勃發展，抗體的小型化是基因工程抗體的一個主要研究方向，其中單域重鏈抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH) 為駱駝科(駱駝、羊駝或美洲駝)及鯊魚體內存在的天然缺失輕鏈的單鏈抗體，由3個互補決定區(complementarity determining regions，CDRs) 構成，其晶體結構呈橢圓形，直徑為2.5 nm，長為4 nm，所以又稱為納米抗體(nanobody，Nb)[13-14]。納米抗體與單克隆抗體相比，由于天然缺乏Fc端識別位點，因此可有效避免與SpA結合導致的假陽性問題[15]。另外，納米抗體還具有以下優點：具有更長的CDR3區，故具有較多的柔韌性和凸面性，使其更好地與抗原表面的裂縫和腔隙相結合，從而提高納米抗體的親和力和抗原特異性；體積小、穩定性高、水溶性好，可在微生物系統中大量合成表達，為納米抗體低成本、高效率的生產創造了條件。基于以上優點，納米抗體已被廣泛應用于食品安全檢測及臨床診斷中，如黃曲霉毒素B1、Cry1Ac蛋白和赭曲霉毒素A等的檢測[16-22]。

本實驗室在前期工作中，已采用生物淘選策略從SEB納米抗體噬菌體展示文庫中淘選得到2株SEB的納米抗體配對組合。以其中1株納米抗體作為捕獲抗體，以另一株噬菌體展示的納米抗體作為檢測識別元件，建立一種基于納米抗體的靈敏度高、特異性強且適用于食品及農產品樣品中SEB檢測的ELISA方法。該方法以納米抗體作為識別元件，避免了以單克隆抗體作為識別元件的傳統ELISA方法存在的與SpA結合導致的假陽性問題，具有較好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

SEB納米抗體噬菌體展示文庫、抗SEB B6噬菌體、抗SEB B7納米抗體、M13 KO7輔助噬菌體、金黃色葡萄球菌CATCC 29213、金黃色葡萄球菌CATCC 26111、金黃色葡萄球菌CATCC 25925、E.coliTop10 、E.coliTG1,由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

細胞裂解液(B-PERTMBacterial Protein Extraction Reagent)，Thermo Fisher公司；辣根過氧化物酶標記M13 單克隆抗體，Santa Cruz公司；Ni2+- NTA親和層析柱，GE Healthcare公司；脫脂奶粉，上海生工生物工程技術服務有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、低分子質量蛋白質Marker、卡那霉素(Kanamycin，Kana)、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)，北京索萊寶公司；其他試劑均為分析純,sigma公司。

1.1.3 主要儀器與設備

Bio-Rad Gel Doc 凝膠成像系統、迷你型垂直凝膠電泳儀，美國伯樂公司；全溫度恒溫培養搖床、微量移液器，美國 Thermo 公司；2K-15低溫離心機，Sigma 公司； SpectraM axM酶標儀，美國Molecular Devices 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 噬菌體的擴增

在含 100 μg/mL Amp的LB平板上挑取E.coliTG1接種于 5 mL含 100 μg/mL Amp的LB液體培養基中， 37 ℃，靜置培養 12 h；按 1% 接種量接種于含 100 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37 ℃，220 r/min培養至OD600約為 0.3，按 20∶1 (感染復數)加入M13 KO7輔助噬菌體，靜置 15 min后，37 ℃，220 r/min培養 1 h；將培養液在 4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，去上清，用等體積的含 100 μg/mL Amp、30 μg/mL Kana的LB培養基重懸，30 ℃、220 r/min培養 5～8 h； 4 ℃、8 000 r/min離心 10 min，取上清，加入 0.2體積的PEG/NaCl溶液，4 ℃靜置過夜；4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，棄上清，加入1 mL 50%(體積分數)甘油重懸噬菌體沉淀，即得到抗SEB B6噬菌體，并于-80 ℃條件下保存。

1.2.2 納米抗體的表達與條件優化

將納米抗體B7的載體轉入E.coliTOP10 感受態細胞中，涂布于含 100 μg/mL Amp的LB平板上，37 ℃、250 r/min培養 12 h；在該平板上挑取一個單菌落接種于 5 mL含 100 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37 ℃、250 r/min培養過夜；按 1% 接種量接種于含 100 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37 ℃、250 r/min培養至OD600約為 0.6，加入終濃度為 1 mmol/L的IPTG進行誘導表達；4 ℃、5 000 r/min離心 8 min，棄上清，按每克菌體加入 5 mL B-PER細胞裂解液，靜置 15 min；4 ℃、10 000 r/min離心 10 min，收集上清，用 0.22 μm濾器過濾上清，再經Ni2+-NTA柱純化，具體步驟參考產品說明書，而后透析得到納米抗體B7，SDS-PAGE分析純化后的納米抗體純度，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定納米抗體B7濃度。此外，并對誘導表達的溫度(20、24、28、32、37 ℃) 和時間(2、4、6、8、10 h) 2個關鍵條件進行優化。

1.2.3 棋盤滴定

用PBS將納米抗體B7稀釋至 16、8、4、2、1、0.5、0 μg/mL，加入 96 孔酶標板中，100 μL/孔，4 ℃包被過夜；PBST洗板 3次，加入體積分數3% 的脫脂牛奶，300 μL/孔，37 ℃封閉 2 h；PBST洗板 3次，加入 100 ng/mL的SEB，100 μL/孔，37 ℃孵育45 min；PBST洗板 3次，用PBS稀釋抗SEB B6噬菌體至滴度為 1010、109、108、107PFU/mL，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 6次，加入HRP標記的抗M13 噬菌體的單克隆抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 3次，加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育 10 min；加入 2 mmol/L的H2SO4，50 μL/孔，終止反應，立即用酶標儀讀取OD450值。

1.2.4 標準曲線繪制

將納米抗體B7稀釋至8 μg/mL，加入96孔酶標板中，100 μL/孔，4 ℃包被過夜；PBST洗板3次，加入 3% 的脫脂牛奶，300 μL/孔，37 ℃封閉 2 h；PBST洗板體積分數3次，加入用PBS溶液稀釋至終濃度為 0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 ng/mL的SEB標準品，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 3次，加入滴度為 109PFU/mL的抗SEB B6噬菌體，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 6次，加入HRP標記的抗M13 噬菌體的單克隆抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育 45 min；PBST洗板 3次，加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃孵育 10 min；加入 2 mmol/L的H2SO4，50 μL/孔，終止反應，用酶標儀讀取OD450值。

1.2.5 最低檢出限的測定

隨機選取 20 份經商業化試劑盒確證為SEB陰性的牛奶、牛肉以及西瓜汁樣品，用本研究建立的ELISA方法檢測上述陰性樣品(每個樣品重復測定 5次)，根據所構建的定量檢測標準曲線計算出每個陰性樣品中SEB的濃度，以 20 個陰性樣品計算獲得的SEB平均濃度加上3倍的標準偏差即為該方法檢測牛奶中SEB的最低檢出限。

1.2.6 特異性分析

配制終質量濃度為 0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 ng/mL的SEA、SEB、SEC，并將金黃色葡萄球菌CATCC 29213、金黃色葡萄球菌CATCC 26111、金黃色葡萄球菌CATCC 25925 稀釋至終濃度為 107、106、105、104、103、102CFU/mL，用本研究建立的ELISA方法進行檢測，記錄OD450值，以評價該方法的特異性。

計算交叉反應率，如公式(1)所示：

(1)

式中：Cr，交叉反應率，%；SC50analog，類似物半飽和信息值濃度；SC50SEB，SEB半飽和信息值濃度。

1.2.7 加標回收實驗

取經商業化試劑盒確證為SEB陰性的樣品提取液，分別添加SEB標準品至終質量濃度為 1 600、800、400、200 ng/mL，稀釋 10 倍后分別用本研究建立的ELISA方法檢測其中的SEB濃度，每個樣品測定 6次，得出每個加標濃度的平均回收率，以評價該方法的準確度。

2 結果與分析

2.1 納米抗體表達條件優化

誘導溫度不僅會影響菌體的生長，同時也影響著重組蛋白的誘導表達水平和蛋白的可溶性[23]。本研究在培養基中加入 1 mmol/L IPTG，分別在不同的溫度下(20、24、28、32、37 ℃) 誘導表達 8 h后，通過全菌體的SDS-PAGE圖譜對納米抗體B7表達量進行分析。結果如圖1所示，當誘導溫度為 32 ℃時，表達量最大，因此確定 32 ℃為最佳表達溫度。

M-蛋白質Marker; 1～5- 20、24、28、32，37 ℃下的全菌體圖1 不同誘導溫度下納米抗體B7表達量的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of nanobody B7 expressionat different induction temperatures

隨著誘導表達時間的延長，納米抗體的表達量趨于平穩，為了使納米抗體的表達量達到最大且耗時最短，本研究在培養基中加入 1 mmol/L的IPTG、于最優誘導溫度 32 ℃的條件下分別誘導表達不同時間(2、4、6、8、10 h)，通過全菌體的SDS-PAGE圖譜分析納米抗體表達量。結果如圖2所示，當誘導表達 8 h時納米抗體表達量達到最大，因此在后續表達實驗中誘導表達最佳時間為 8 h。

M-蛋白質Marker; 1～5-誘導時間為 2、4、6、8、10 h下的全菌體圖2 不同誘導時間納米抗體B7表達量的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of nanobody B7 expression indifferent induction time

2.2 納米抗體的純化

將宿主菌E.coliTop10 于最優的條件下進行表達，1 mmol/L的IPTG，32 ℃誘導表達 8 h，離心收集菌體經細胞裂解液裂解后，收集上清進行鎳柱純化，純化后的納米抗體進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示，蛋白分子質量約為 17 kDa，與理論分子質量大小相符，純化后條帶單一、無雜帶，說明具有較高的純度，并且對納米抗體濃度進行檢測，得出納米抗體B7的表達量為 6.2 mg/L。

M-蛋白質Marker; 1-純化后的納米抗體圖3 納米抗體純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of nanobody B7 after purification

2.3 棋盤滴定

要實現ELISA方法的高靈敏檢測，抗原抗體的結合部位應以充分暴露在抗原表面且配對抗體抗原識別位點相對較遠為宜，在此基礎上，摸索出抗體的最佳使用濃度。本研究在前期研究中已確定了SEB的納米抗體配對組合，現通過棋盤滴定法確定納米抗體B7和抗SEB B6噬菌體的最佳用量。結果如圖4所示，最佳納米抗體的濃度為 8 μg/mL，最佳抗SEB B6噬菌體的滴度為 109PFU/mL。

圖4 棋盤滴定法確定納米抗體和噬菌體的最優工作條件Fig.4 Checking the optimal working conditions ofnanobody and phage by checkerboard titration

2.4 標準曲線的繪制

在最適條件下，利用ELISA方法檢測 16 個不同SEB加標質量濃度的陰性樣品，結果顯示隨著SEB質量濃度的增加，OD450值逐漸增加，并且以SEB質量濃度為橫坐標，OD450值為縱坐標繪制標準曲線，該ELISA方法的定量線性范圍為 16～1 024 ng/mL。線性回歸方程為y=0.239 4 lnx-0.490 1，線性相關系數(R2) 為 0.99。隨機檢測 20 個陰性樣品，經標準曲線計算獲得該方法檢測實際食品樣品中SEB的最低檢出限為(9.58±0.07) ng/mL，以上結果表明，該方法在食品樣品中加標SEB具有較高的檢測靈敏度。

2.5 特異性實驗

為評估該方法的特異性，本研究選取3株金黃色葡萄球菌(CATCC 29213、CATCC 26111和CATCC 25925)、SEA及SEC作為檢測對象，用已確證為陰性的樣品提取液配制系列加標溶液，采用本研究建立的ELISA方法進行檢測，并依據交叉反應率公式評價ELISA的特異性。

結果如表1所示，該方法與SEC有 42.18% 的交叉，與SEA及3株金黃色葡萄球菌無明顯交叉。目前，基于ELISA的腸毒素檢測方法已經較為成熟，但是始終無法避免與SpA結合導致的假陽性問題[24]。國家標準SN/T 1763. 2-2006(2010) 規定采用ELISA方法檢測進出口食品中的SEB，但該方法是以單克隆抗體作為識別元件，可導致與金黃色球菌SpA高親和性結合出現假陽性的結果[25]，使得檢測數據不準確。該方法因納米抗體無Fc端可有效避免與spA結合導致的假陽性問題，可用于特異性檢測食品樣品中的SEB污染，且不受其他物質干擾。

表1 ELISA與其他結構類似物及其產生菌的交叉反應率Table 1 The cross-reactivity of ELISA with other agonists and SAs

2.6 加標回收實驗

采用SEB加標回收實驗評價所建立的ELISA方法的準確度，實驗結果如表2所示，分別在陰性的牛奶、牛肉和果汁中添加終質量濃度為 200、400、800、1 600 ng/mL的SEB標準品，經樣品前處理后，用本研究建立的ELISA方法進行檢測，結果顯示該方法在牛奶、牛肉和西瓜汁樣品的回收率分別為 87.26%～108.43%，79.36%～106.56% 和 83.81%～99.43%，變異系數為2.77%～16.15%，表明該方法具有較好的準確性及重現性。

3 結論

SEB是牛乳等食品中常見的生物毒素之一，半致死劑量僅為 20 ng/kg，實現在食品基質中的SEB高靈敏檢測對于維護食品安全具有重要意義。基于抗原抗體特異性反應原理的酶聯免疫檢測方法，本身就具有特異性強、靈敏度高的特點，加之納米抗體的低免疫原性、高水溶性、低成本以及天然缺失Fc端的特點，可實現對SEB的準確定量，使得該方法具有很高的實際應用價值。

表2 加標回收實驗結果Table 2 Results of sample spiked recovery experiment

本研究建立的納米抗體-噬菌體夾心ELISA方法，在 16～1 024 ng/mL具有良好的線性關系，最低檢出限為(9.58±0.07)ng/mL。由于SEB和SEC同源性較強，而與SEA同源性弱，故該方法表現出與SEC存在一定的交叉，而與SEA無明顯交叉。該方法可用于食品中SEB的初步定量及高通量篩查，為檢測食品中的SEB污染及篩選SEB陽性菌株提供了有效方法，也為準確檢測食品中SEB的含量提供了新思路。隨著基因工程抗體技術的發展，有望通過定向突變的方法進一步提高2株納米抗體的親和力及特異性，以期實現食品中SEB的高靈敏檢測。