產腸毒素大腸桿菌3×STa-ovalbumin融合蛋白的血清學評價

王錄軍,王韋華

(渭南職業技術學院， 陜西 渭南 714000 )

Ⅰ型耐熱腸毒素(Heat-stable toxin type I，STa)是產腸毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)引起人和動物腹瀉產生的兩類主要腸毒素之一[1]。STa毒素是由18(豬源)或19(人源)個氨基酸組成的短肽[2, 3]。它們在氨基酸序列和生物學活性上具有相似性。但是由于STa毒素的分子量小，只有與載體蛋白偶聯才具有免疫原性。STa基因在從幼齡動物、兒童和旅行者腹瀉者分離的ETEC菌株中普遍攜帶[4, 5]。

雖然酶聯免疫技術(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是檢測ETEC疫苗誘導機體產生抗STa抗體的簡單、快速和準確的方法，但是該方法的應用仍然面臨一些問題。STa-ovalbumin化學偶聯物是目前應用于ELISA檢測STa抗體唯一的包被抗原[6, 7]?；瘜W偶聯的過程中要求純化的STa毒素，但是純化僅具有18或19個氨基酸的STa短肽，目前的技術還不成熟。雖然目前有幾個實驗室具備純化具有生物活性的STa純毒素的能力，但是通常產量低至每升生長培養基僅能純化0.5～1 mg的STa純毒素。另外，純化的STa毒素和卵清蛋白(ovalbumin)化學偶聯的效率也不高。這使STa-ovalbumin偶聯物的供應量非常有限。因此，急需研發一種新的包被抗原替代目前應用的STa-ovalbumin化學偶聯物。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒及試劑

E. coli DH5α，E. coli BL21(DE3)和pET-28α質粒均由渭南職業技術學院實驗室保存。IPTG購于美國Sigma公司，IRDye標記的羊抗兔IgG購于美國NE公司，抗STa的陽性血清系美國堪薩斯州立大學Ronald教授饋贈，STa抗體陽性或陰性豬、兔和小鼠血清均為本實驗室保存。

1.2 融合蛋白的構建和表達

3個拷貝的人源的estA基因(編碼人源STa)利用重疊延伸PCR技術(gene splicing by overlap extension?PCR，SOE-PCR)分別嵌合至修飾的雞ovalbumin基因的N端、C端和中部。其中estA基因與ovalbumin基因N端、C端之間用GPVD接頭連接。構建的3×STa-ovalbumin嵌合基因采用原核表達，純化后的融合蛋白進一步用SDS-PAGE電泳分析；以兔STa陽性血清為一抗(1∶3 000)，IRDye標記的羊抗兔IgG(1∶10 000)為二抗，進行western Blot分析。

1.3 融合蛋白結構預測

先將3×STa-ovalbumin融合蛋白的氨基酸序列用Phyre2在線服務器對蛋白三級結構進行預測，PDB文件采用PyMOL軟件對融合蛋白的表面結構進行分析。

1.4 最佳抗原包被劑量的優化

用方陣滴定法確定最佳抗原包被劑量：橫列將融合蛋白抗原從每孔6.25 ng、12.5 ng、25 ng、50 ng或每孔10 ng STa-ovalbumin化學偶聯物包被，豎排將血清按1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600和1∶51 200倍比稀釋?；靹蛴?7℃孵育1 h，用PBST洗滌3次；然后加用羊抗鼠IgG-HRP的二抗37℃孵育1 h。PBST洗滌3次后，每孔加入100μL的TMB室溫顯色30 min。在650 nm處以空白對照孔調零后讀取各孔的吸光值(OD值)。OD650值與包被為每孔10 ng STa-ovalbumin化學偶聯物的讀值最為接近的確定為最佳包被劑量。試驗重復3次。

1.5 敏感性和特異性檢測

以每孔25 ng的融合蛋白劑量作為包被抗原，以豬抗STa抗體陽性血清連續倍比稀釋(1∶400至1∶51 200倍)作為檢測血清，采用間接ELISA方法檢測其對抗STa抗體的敏感性。85份豬、兔和小鼠的抗STa陽性或陰性血清用于融合蛋白對抗STa抗體的特異性檢測。所有血清樣品先用每孔10 ng STa-ovalbumin化學偶聯物作為包被抗原進行ELISA檢測，確診為抗STa陽性或陰性血清。當OD650讀值減去空白對照孔讀值>0.3時，結果判定為陽性，讀值<0.3時，結果判定為陰性。試驗重復3次，每個樣品設置2個平行孔。

1.6 數據分析

實驗數據統計采用Student's t-test 軟件，當p<0.05時，判定為差異顯著。

2 結果

2.1 融合蛋白的構建和表達

DNA測序結果確認3×STa-ovalbumin嵌合基因中包含3個拷貝的STa基因和內含子縮短的ovalbumin基因。3個STa基因分別位于ovalbumin基因的N端、C端和中間部位。融合蛋白以包涵體的形式表達，目的蛋白純化后純度超過90%，分子量大小約為40 KDa，與預期的大小一致；且能與兔抗STa陽性血清特異性反應 (圖1)。

圖1 3×STa-ovalbumin融合蛋白的Western blot分析

2.2 融合蛋白結構預測

蛋白結構預測結果表明，在N、C端和中間部位分別插入1拷貝的STa后并未破壞Ovalbumin蛋白的結構，進一步的分析表明，3個拷貝的STa均位于融合蛋白的表面(圖2)。

圖2 3×STa-ovalbumin融合蛋白的三級結構預測。白色標記的為STa多肽。

2.3 融合蛋白的最佳包被劑量

依據試驗中方陣ELISA測試結果表明，當包被劑量為每孔50 ng時，檢測抗STa陽性血清的敏感度最高。而當包被劑量為每孔25 ng時，其對STa抗體陽性血清的檢測靈敏度與每孔包被10ng STa-ovalbumin化學偶聯物的敏感度相當。所以每孔25 ng是3×STa-ovalbumin融合蛋白作為包被抗原檢測抗STa陽性血清的最佳包被劑量。

2.4 敏感性和特異性試驗結果

當選用每孔25 ng的融合蛋白作為包被抗原檢測STa抗體陽性血清時，其檢測血清的最高稀釋倍數為1∶51 200 (圖3)。與使用STa-ovalbumin化學偶聯物作為包被抗原的ELISA檢測比較，融合蛋白作為包被抗原檢測的特異性為100% (表1)。

圖3 抗STa抗體的敏感性檢測

樣品名稱樣品總數STa-ovalbumin化學偶聯物作為包被抗原檢測3×STa-ovalbumin融合蛋白作為包被抗原檢測陽性樣品數陰性樣品數陽性樣品數陰性樣品數STa陽性血清48480480STa陰性血清37037037

3 討論

評估ETEC疫苗有效性的最快速和可靠的方法是用ELISA方法檢測疫苗誘導機體產生的抗體水平[8]。但是，目前檢測機體的STa抗體水平仍面臨居多挑戰。STa-ovalbumin化學偶聯物是當前應用ELISA方法檢測抗STa抗體反應唯一使用的包被抗原[6, 7]。但是，STa-ovalbumin化學偶聯物的制備程序復雜，而且產量低和不穩定。因此，目前急需研發一種替代STa-ovalbumin化學偶聯物的新的包被抗原。我們的研究數據表明，3×STa-ovalbumin融合蛋白可作為抗STa抗體ELISA檢測的包被抗原。

我們的試驗證明，E. coli原核表達3×STa-ovalbumin融合蛋白產量高達40mg每升培養基，而且純度超過90%。與STa-ovalbumin化學偶聯物的制備方法相比，融合蛋白的制備方法簡單、成本低，而且產量高。但是該融合蛋白的蛋白特性需進一步研究。用ELISA方法檢測STa抗體時，用融合蛋白作為包被抗原與用STa-ovalbumin化學偶聯物作為包被抗原具有相同的敏感性和特異性。但是，檢測的敏感性和特異性還需要更多的樣品進行驗證。

總之，與STa-ovalbumin化學偶聯物的生產相比，新的融合蛋白的生產更簡單、快速和成本低廉，而且作為包被抗原對STa抗體的檢測具有相同的效果。因此，我們的試驗結果證明，新構建的3×STa-ovalbumin融合蛋白可以替代STa-ovalbumin化學偶聯物作為ELISA方法檢測STa抗體的包被抗原。