宰前飲用復合磷酸鹽水對延邊黃牛肉血清生化、肌纖維結構及蛋白質表達的影響

張 亮 侯婷婷 田學宗 劉 鑫 梁成云 許海林 崔泰花 李官浩

(1. 延邊大學食品研究中心，吉林 延吉 133000；2. 北京尚德在線教育有限公司，北京 100193； 3. 龍井長白山犇福清真肉業有限公司，吉林 延吉 133000)

應激是指動物受到體內外非特異性的、異常的、不良的脅迫因子刺激或長期作用時，會引起非特異性、生理性緊張狀態的反應，并由此引起各種機能和代謝改變，來提高機體的適應能力和維持內環境的相對穩定[1]。肉牛屠宰放血后為了維持肌肉結構完整、保持一定溫度和彈性仍需消耗ATP，加上屠宰時異常恐懼和痙孿，肌肉激烈收縮使ATP分解，宰后胴體肌細胞又過多地消耗ATP，糖原酵解加強，產生大量乳酸使pH值迅速下降，導致肌內膜變性、崩裂，肌外膜組織脆弱，致密性下降，肌球蛋白變性，持水性降低，肌紅蛋白隨水分大量流失，進而產生劣質肉[2]。劣質肉不僅口感差、貨價期短、不適宜深度加工，而且由于色澤異常很難被消費者接受，降低了肉生產的附加值，影響經濟效益。因此，降低動物宰前應激對改善肉質有重要的作用。

磷酸鹽是應用最為廣泛的食品添加劑之一。目前已有大量研究[3-5]表明，磷酸鹽可作為品質改良劑應用于肉制品當中。磷酸鹽在肉類加工中的主要作用有：保水、助滲透以及殺菌等，其中最主要的是保水作用。在肉品質研究中，可運用“蛋白質組學”來尋找預測肉嫩度的標記蛋白質[6]，現已證實：肌鈣蛋白(Troponin)、肌間線蛋白(Desmin)、半肌動蛋白(Nebulin)、肌聯蛋白(Titin)等蛋白與肌肉嫩度相關[7]。其中Troponin-T作為一種可調節的蛋白質，與Troponin-Ⅰ亞基和Troponin-C亞基共同形成鈣離子敏感調控開關，可以調節橫紋肌的伸長與收縮[8-9]。在延邊黃牛肉品質的研究中，已有學者采用蛋白質組學來研究其對肉品質的影響[10]，相比之下，通過Desmin和Troponin-T的表達量來探究延邊黃牛宰前飲用復合磷酸鹽水來緩解宰前應激的研究尚未見報道。

試驗擬將延邊黃牛分為4組，對照組飲用自來水，試驗組(A、B、C)分別飲用濃度為0.05%，0.10%，0.15%的復合磷酸鹽水。研究其對延邊黃牛肉品質指標、血清生化指標及相關蛋白質表達量的影響，以確定復合磷酸鹽的適宜添加量，為降低延邊黃牛宰前應激及改善肉質的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

延邊黃牛：延邊朝鮮族自治州龍井市犇福牧場；

焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉：食品級，市售；

牛皮質醇(COR)酶聯免疫檢測試劑盒、牛促腎上腺皮質激素(ACTH)酶聯免疫檢測試劑盒、BCA濃度測定試劑盒：索萊寶生物科技有限責任公司；

鉬酸銨、磷酸二氫鉀、甲醛、尿素、硫脲、丙磺酸、二硫蘇糖醇等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

標準規格酶標儀：ELx800型，美國Bio-TECK有限公司；

旋轉式切片機：RM2255型，上海醫療器械廠；

攤片機：KD-P型，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；

烘片機：KD-H型，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；

多功能顯微鏡：OLMPUS型，日本OLMPUS光學株式會社；

電泳儀：164-5050型，美國伯樂公司；

蛋白轉印儀：BIO-RAD型，美國伯樂公司；

化學發光成像儀：Alliance型，英國UVItec公司；

電子天平：FA1104N型，上海精密科學有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組 試驗分組如表1所示，復合磷酸鹽水為焦磷酸鈉∶三聚磷酸鈉∶六偏磷酸鈉=1∶5∶14(質量比)復合得到。

表1 試驗動物分組情況

1.2.2 血樣采集 延邊黃牛宰前禁食禁水期間，用抗凝采血管(EDTA)采集延邊黃牛頸靜脈新鮮血液適量，并在采血管空白處進行標號。需將抗凝采血管勻速搖晃，以使血液能夠與采血管中的抗凝劑充分接觸，在4 ℃，3 000 r/min 下離心10 min，收集上清分裝于滅菌的1.5 mL 離心管中，并于-20 ℃冰箱中保存，以備指標測定分析。

1.2.3 牛皮質醇(COR)含量的測定 采用牛皮質醇酶聯免疫檢測試劑盒。

1.2.4 牛促腎上腺皮質激素(ACTH)含量的測定 采用牛促腎上腺皮質激素酶聯免疫檢測試劑盒。

1.2.5 血液生化指標的測定 采用全自動生化分析儀進行血液生化指標的測定。

1.2.6 肌纖維結構的測定 將切取的肉塊用10%中性福爾馬林水溶液固定，將固定好的肉樣修整結束后，進行脫水處理。處理好的肉樣用石蠟包埋，而后進行切片、攤片、烘干，最后染色，并使用顯微鏡觀察。

1.2.7 肌纖維組織學性狀測定(直徑、表面積、周長) 采用HE染色法對切片進行染色，將染好色的切片置于顯微鏡下觀察，用圖像處理軟件CellSens Entry，選擇多邊形選項對各個形狀進行測定和記錄。

1.2.8 總蛋白的裂解 將400 μL裂解液與4 μL蛋白酶抑制劑裝于1.5 mL離心管內，置于冰上。切取適量組織(約200 mg)投入研缽中加入適當液氮研磨，取適量于上述裂解液中，置于冰塊上15 min。在超聲機20%功率(100 W)下超聲，超聲2 s停止8 s，共超聲10 min。將超聲完的樣品在4 ℃下離心10 min，離心轉數為13 000 r/min。離心后的上清液即為所需全蛋白。蛋白提取液在超低溫冰箱-80 ℃下保存。

1.2.9 蛋白質濃度的測定 采用BCA濃度試劑盒。

1.2.10 Western Blot檢測 將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，取出條帶加入ECL超敏發光液，用凝膠成像儀進行CCD掃描。

1.2.11 數據處理方法 所有試驗重復3次，試驗數據的基本整理采用WPS 2018款最新軟件；采用SPSS Statistics 17.0統計軟件對試驗結果進行方差分析，并采用鄧肯檢驗法標記差異顯著性，分析結果用“平均值±標準差”表示，P<0.05為結果差異顯著。

2 結果與討論

2.1 對血清中ACTH、COR含量的影響

ACTH和COR濃度是評價應激程度的重要指標，一般而言應激程度越大，ACTH和COR濃度越高。復合磷酸鹽處理對延邊黃牛血清中的ACTH含量影響如圖1所示，對照組ACTH含量顯著高于試驗組(P<0.05)，3個試驗組間ACTH含量無顯著差異(P>0.05)，其中試驗組B的含量最低，為(14.93±2.35) pg/mL。復合磷酸鹽處理對延邊黃牛血清中的COR含量影響如圖2所示，對照組的COR含量顯著高于試驗組(P<0.05)，各試驗組之間的COR含量差異顯著(P<0.05)，其中試驗組A的COR含量最低，為(26.29±4.70) ng/mL。

柴進等[11]在宰前應激對豬肉質的影響及其機制研究中也闡述了應激對HPA的影響，說明了ACTH和COR的相互作用，當COR分泌時反過來又抑制CRF和ACTH的釋放。試驗結果顯示試驗組的ACTH和COR濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，說明在宰前飲用復合磷酸鹽水后會減少宰前應激并降低血液中COR和ACTH濃度。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effect of compound phosphate treatment on content of ACTH in Yanbian cattle blood

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Effect of compound phosphate treatment on content of COR in Yanbian cattle blood

2.2 對血清激素和酶的影響

復合磷酸鹽處理對延邊黃牛肉血清生化指標的影響如表1所示。血清酶的最主要來源是動物的特定組織器官，其活性高低與相應組織器官的代謝能力和功能狀態有著直接的關系[12]。當機體處于應激狀態下，機體的承受能力會被打破，機體的內環境及一些組織如心臟、肝臟、脾臟、腎、肌肉、淋巴和免疫器官不可避免地遭受病理性損傷和破壞，導致細胞膜的通透性發生變化致使血清酶的含量發生變化[13]。試驗結果顯示，試驗組的CK含量顯著低于對照組(P<0.05)，試驗組B和C的LDH含量顯著低于對照組(P<0.05)。仲慶振等[14]研究表明在宰前應激存在情況下，血液中的CK和LDH含量會顯著提高，其原因是宰前應激過度消耗了機體能量導致心肌受到一定損傷，破壞細胞膜。血糖作為體內代謝過程的重要物質，可以反映機體的能量變化[15]。在應激狀態下，使機體的HPA軸興奮增強，提高糖原酵解速度，從而提供葡萄糖作為能量同時也能夠剌激肌肉、淋巴以及結締組織中的糖異生作用，導致血糖升高。試驗結果顯示，試驗組的GLU含量顯著低于對照組(P<0.05)，3個試驗組間無顯著差異(P>0.05)。Hana等[16]表明在應激狀態下時，體能消耗增大同時也增加了血液中的GLU含量來適應應激，其研究結論與韓瑾瑾等[17]的一致。AST含量最多的是心肌、其次為肝臟和骨骼肌，應激會使AST含量升高，可能是由于應激時心肌收縮力加強，血液循環加速，心肌細胞代謝加強，使其更新或受損加快所致[18]。Pérez等[19]研究發現，豬血液中的活性在經歷運輸等應激后也會明顯升高。試驗結果顯示，試驗組的AST含量顯著低于對照組(P<0.05)，其中試驗組B的AST含量最低。ALP廣泛存在于組織和體液中[20]，李鵬飛等[21]對黃芪多糖粉和銀黃粉緩解羊運輸應激的研究表明，各種應激原的作用使得羊骨骼和肌肉受到損傷致使ALP進入血液，加上長時間的禁食禁水也會對小尾寒羊膽汁的生成和分泌造成影響，使得血液中ALP含量升高。試驗結果顯示，試驗組的TP和CHO含量與對照組無顯著差異(P>0.05)。試驗組A的ALP和TG含量與對照組無顯著差異(P>0.05)，試驗組B和C均顯著高于對照組(P<0.05)。以上試驗結果說明，宰前飲用復合磷酸鹽水能夠降低在宰前應激存在情況下機體組織的受損程度，且降低血清中相關酶的含量，同時也證明了宰前飲用水中添加復合磷酸鹽對減少宰前應激有一定作用，其中試驗組B效果最佳。

表2 復合磷酸鹽處理對延邊黃牛血清激素和酶的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 對血清無機離子的影響

復合磷酸鹽處理對延邊黃牛血清無機離子指標的影響如表3所示。血清中的無機鹽離子在機體血液中起到了至關重要的作用，能夠維持血液滲透壓、血漿酸堿平衡以及機體正常生命活動[22]。總結有關應激對無機離子指標的影響發現，應激對血清中無機離子指標的影響尚沒有明確變化規律。Mota-Rojas等[23]研究發現，釆用CO2擊暈應激會升高血液中K+的濃度，但Pérez等[19]研究發現屠宰應激不會引起血液中的K+含量變化。試驗結果顯示，試驗組A和C的Na+與對照組無顯著差異(P>0.05)，試驗組B的含量顯著低于對照組(P<0.05)。試驗組與對照組相比，K+和Ca2+含量無顯著差異(P>0.05)，均處于家畜的正常范圍。試驗組B有最低的Na+和Cl-且顯著低于對照組(P<0.05)。以上試驗結果說明，宰前飲用復合磷酸鹽水對延邊黃牛血清無機離子指標無顯著影響，而離子指標間的差異還需進一步研究。

2.4 對肌纖維結構的影響

由表4可知，對照組的肌纖維面積顯著高于試驗組B(P<0.05)，與試驗組A和C的無顯著差異(P>0.05)。對照組的肌纖維周長顯著高于試驗組B(P<0.05)，與試驗組A和C的無顯著性差異(P>0.05)；試驗組C的肌纖維周長顯著高于試驗組A和B(P<0.05)。對照組的肌纖維直徑顯著高于試驗組B和C(P<0.05)，與試驗組A的無顯著性差異(P>0.05)。貯藏初期肌纖維結構觀察圖(200倍)見圖3。

表3復合磷酸鹽處理對延邊黃牛血清無機離子指標的影響?

Table3EffectofcompoundphosphatetreatmentonbloodbiochemicalionindexofYanbiancattle mmol/L

組別Ca2+K+Cl-Na+對照組2.03±0.0515.30±0.27102.40±1.05a137.57±0.67a試驗組A1.96±0.0715.42±0.17102.30±0.50a138.40±1.14a試驗組B2.08±0.0815.44±0.3999.27±0.93b135.87±0.23b試驗組C1.98±0.0715.64±0.89102.73±0.60a138.03±0.83a

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

肌組織學與肉品質密切相關。研究[13]表明，肌纖維的密度越大，直徑和面積越小，肉質越鮮嫩；肌纖維的密度越小，直徑和面積越大，肉質越差，這是由于肌原纖維越粗締合越牢固越難斷裂。應激會對肉質品肌纖維直徑和面積有一定影響，影響機制為應激使肉牛肌肉組織中糖原含量減少，產生乳酸減少pH值升高，內源性組織蛋白酶活性受到抑制，減緩了成熟過程中肌膜的溶解速率，導致肌纖維結構發生變化[20]。試驗結果顯示，試驗組的肌纖維面積和直徑均低于對照組，其中試驗組B的面積和直徑顯著低于對照組(P<0.05)。以上試驗結果說明，宰前飲用復合磷酸鹽水對延邊黃牛肉貯藏初期肌纖維組織學特性有一定改善作用，其中試驗組B效果最顯著。從貯藏初期肌纖維結構觀察圖可以看出，試驗組肌束之間的擴散程度均小于對照組，可能是宰前飲用復合磷酸鹽水，減少了肌組織內部的能量消耗造成的。

表4復合磷酸鹽處理對貯藏初期延邊黃牛肉肌纖維結構的影響?

Table4EffectofcompoundphosphatetreatmentonmusclefiberstructureofYanbiancattleinearlystorage

組別肌纖維面積/μm2肌纖維周長/μm肌纖維最小直徑/μm對照組1 630.55±154.44a166.70±11.57ab137.57±0.67a試驗組A1 606.53±128.68a160.50±9.93b138.40±1.14a試驗組B1 477.30±155.38b151.50±10.78c135.87±0.23b試驗組C1 599.37±140.41a169.60±11.15a138.03±0.83a

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖3 貯藏初期肌纖維組織結構圖

2.5 對Troponin-T表達量的影響

由圖4可知，外脊和眼肉的試驗組C無明顯的目的條帶，其余3組有較為明顯的目的條帶。肌鈣蛋白與肉的嫩度之間有直接的關系，但其作用機理還不明確需要進一步的研究。Troponin-T可以起到調節肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互作用，它與原肌球蛋白一起調節肌肉收縮時的細絲，同時還促進I帶中細絲的損壞，Troponin-T的降解有利于提高肉的嫩度。Lametsch等[24]認為38 kDa 的Troponin-T在宰后積累升高。研究[25]表明，Troponin-T是內源性μ-鈣激活酶的作用底物，被降解后會引起肌纖維粗絲和細絲的相互作用的損壞，并增加肌原纖維的小片化，其降解產物的生產量可以很好地反映肉的嫩度。試驗結果顯示，對照組的Troponin-T目的條帶較試驗組更為清晰，說明對照組的Troponin-T的表達量高于試驗組，同時隨著復合磷酸鹽水濃度的增加其蛋白表達量逐漸降低。試驗結果說明，宰前飲用復合磷酸鹽水會降低宰后初期Troponin-T的含量，會對延邊黃牛肉品質產生影響。

2.6 對Creatine Kinase 表達量的影響

如圖5所示，在外脊中試驗組有較為明顯的目的條帶，其中試驗組A和C較試驗組B的目的條帶清晰，對照組無目的條帶。在眼肉中，對照組和試驗組C無明顯條帶，試驗組A和B有較為清晰條帶，其中試驗組A顏色較試驗組B的深。試驗結果顯示，延邊黃牛外脊中試驗組的Creatine Kinase表達量高于對照組，延邊黃牛眼肉中試驗組A和B有較高的蛋白表達量，說明宰前飲用復合磷酸鹽水可提高延邊黃牛肉中Creatine Kinase的表達量，來減少宰前應激所帶來的能量消耗。

Ⅰ. 對照組 Ⅱ. 試驗組A Ⅲ. 試驗組B Ⅳ. 試驗組C

Figure 4 Effect of compound phosphate treatment on troponin-t expression of Yanbian yellow beef rib and rib-eye steak

Ⅰ. 對照組 Ⅱ. 試驗組A Ⅲ. 試驗組B Ⅳ. 試驗組C

Figure 5 Effect of compound phosphate treatment on Creatine Kinase expression of Yanbian cattle rib and rib eye steak

3 結論

試驗結果表明：宰前飲用復合磷酸鹽水對改善延邊黃牛宰后的血液生化指標有顯著作用，可在一定程度上減少宰前應激并可一定程度地降低延邊黃牛肉的肌纖維面積和周長，降低宰后Troponin-T表達量，提高Creatine Kinase表達量有顯著作用。綜合以上試驗結果分析，宰前飲用0.10%的復合磷酸鹽水效果最佳。