檸檬汁粉抗血栓作用及其機(jī)制研究

徐叢玥 林 款 李超英 茹 琴

(江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056)

血栓是多種疾病的誘發(fā)因子或并發(fā)癥，在生理病理認(rèn)識方面，它與中醫(yī)的血瘀證有許多共同之處，活血化瘀療法也是近代中西醫(yī)結(jié)合研究中最活躍的領(lǐng)域之一[1]。現(xiàn)有的抗血栓藥物分為抗血小板藥、抗凝劑類藥物和溶血栓藥/溶纖維蛋白類藥物，不僅價(jià)格昂貴且伴有一定的副作用，根據(jù)中國傳統(tǒng)藥食同源理念，結(jié)合大健康產(chǎn)業(yè)的相關(guān)政策，尋找具有預(yù)防血栓形成功效的動植物食品已成為研究熱點(diǎn)。

檸檬含有豐富的檸檬酸、檸檬烯、黃酮類以及VC等營養(yǎng)成分[2]，是一種藥食同源的水果，在《本草綱目拾遺》[3]《嶺南采藥》[4]等書著中均有其用藥記載。Sengun等[5]研究發(fā)現(xiàn)檸檬具有預(yù)防心血管疾病的功能，但目前從抗血栓方向進(jìn)行的研究報(bào)道較少，僅有陳岑[6]報(bào)道通過體外誘導(dǎo)血小板聚集試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檸檬提取物具有較強(qiáng)的抗血小板聚集活性。

腎上腺素急性給藥加冰水應(yīng)激，會引起血液黏度增高等血液流變學(xué)的變化和血管內(nèi)皮損傷，是氣滯血瘀的表現(xiàn)[7]，這種急性血瘀模型已經(jīng)被廣泛使用，而檸檬汁粉對急性血瘀模型大鼠的血液流變狀態(tài)、抗凝途徑及血管內(nèi)皮損傷的影響目前尚未見報(bào)道。試驗(yàn)擬采用急性血瘀模型，以全血黏度、紅細(xì)胞沉降率、凝血四項(xiàng)、血栓素B2含量等為評價(jià)指標(biāo)，研究檸檬汁粉體內(nèi)抗血栓的作用及機(jī)制，以期為檸檬進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

檸檬：產(chǎn)地四川安岳果；

SPF級昆明大鼠：雌性，體重(200±10) g，動物許可證號SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司；

凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)測定試劑盒、凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)測定試劑盒、活化部分凝血活酶時(shí)間(鞣花酸法)(activated partial thromboplatin time，APTT)測定試劑盒、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)含量測定試劑盒、大鼠6-酮前列腺素F1α(6-keto prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所；

鹽酸腎上腺素注射液：每支1 mL/mg，遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國)有限公司；

阿司匹林腸溶片：25 mg/片，歐意藥業(yè)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速落地冷凍離心機(jī)：J26-XP型，德國Beckman公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1A-50型，上海豫明儀器有限公司；

半自動凝血分析儀：SC40型，北京中勤世帝生物技術(shù)有限公司；

血液黏度分析儀：HMN-6B型，天津海邁醫(yī)用科技有限公司；

Ⅲ生化培養(yǎng)箱：SPX-150B型，天津市泰斯特儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：MULTISKAN GO型，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 檸檬汁粉的制備 參考周玥等[8]的方法并將離心轉(zhuǎn)速稍作調(diào)整。調(diào)整后的方法為：新鮮檸檬經(jīng)洗凈、去皮去籽、切塊后榨汁，過濾，4 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍干燥(溫度-65 ℃，壓強(qiáng)11 Pa)，即得檸檬汁粉，干燥器內(nèi)貯藏備用。

1.2.2 大鼠分組及造模 30只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，體重(200±20) g，分別為正常組、模型組、陽性對照組(阿司匹林100 mg/kg)、檸檬汁粉低劑量組(150 mg/kg)和檸檬汁粉高劑量組(300 mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥7次，早晚各1次(每天早晚8:30給藥，時(shí)間間隔12 h)，灌胃量按大鼠體重1 mL/100 g，于第3天、第5次給藥后開始復(fù)制急性血瘀模型[9-10]。

第3天下午6:00點(diǎn)第1次皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg，2 h后冰浴4 min(控制水溫在0～2 ℃)，將大鼠置于冰水中游泳，晚上8:30給第6次藥，于晚上10:00同等劑量注射第2次鹽酸腎上腺素，之后大鼠只給水飼養(yǎng)。第4天上午8:30最后一次給藥，10:00用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，于腹主動脈取血，測量相應(yīng)的指標(biāo)[11]。

1.2.3 全血黏度和紅細(xì)胞沉降率的測定 全血以肝素抗凝，每1 mL全血添加10～20 U肝素，血液黏度分析儀預(yù)熱后，取0.8 mL待測全血放入檢查盤中，測定血液在不同切變率下的黏度。

將血液采集到血沉管固定刻度后，輕輕顛倒2～3次，血沉管插入血沉架上使血液液面與“0”刻度平行，室溫靜置1 h，讀取上層血漿的高度。

1.2.4 凝血四項(xiàng)的測定 血液以體積比1∶9與抗凝劑0.109 mol/L枸櫞酸鈉混勻，輕輕顛倒3～4次混勻后，3 000 r/min 離心15 min，取上清液備用。

(1) 凝血酶原時(shí)間(PT)：50 μL待測血漿和100 μL PT試劑在37 ℃中分別預(yù)熱10 min，混勻后立刻開始計(jì)時(shí)。

(2) 活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)：取待測血漿50 μL，與50 μL APTT試劑混勻后在37 ℃預(yù)熱3 min，然后加入37 ℃預(yù)熱的0.025 mol/L CaCl2試劑50 μL，記錄儀器測定結(jié)果。

(3) 凝血酶時(shí)間(TT)：取待測血漿100 μL，37 ℃預(yù)熱3 min，然后加入37 ℃預(yù)熱的TT試劑100 μL，記錄儀器測定結(jié)果。

(4) 纖維蛋白原含量(FIB)：取待測血漿10 μL，與90 μL 咪唑緩沖液混勻后在37 ℃預(yù)熱3 min，然后加入37 ℃預(yù)熱的FIB試劑50 μL，記錄儀器測定結(jié)果。

1.2.5 血漿6-keto-PGF1α、TXB2、eNOS、ET-1含量的測定 各組血液在室溫下自然凝固20 min，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，按試劑盒方法測定各組大鼠血漿6-酮前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和內(nèi)皮素-1(ET-1)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0和Origin分析，采用單因素方差分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠全血黏度的影響

全血黏度(whole blood viscosity，WBV)是血液最重要的流變學(xué)特性參數(shù)，是由血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集性、紅細(xì)胞變形性、紅細(xì)胞表面電荷、血漿黏度、纖維蛋白原含量以及白細(xì)胞和血小板流動性等多種因素決定的綜合性指數(shù)。全血黏度越大，血液流動性越小，腦血栓、腦供血不足、心肌梗死和心絞痛的發(fā)病與血液黏度升高有關(guān)，增高的程度可反映心肌缺血的嚴(yán)重性[12]。

由表1可知，在3種不同的切變率下，模型組大鼠的全血黏度均極顯著高于正常組的(P<0.001)，說明大鼠急性血瘀模型造模成功。與模型組相比，檸檬汁粉高劑量組的全血黏度在各切變率下均極顯著下降，而檸檬汁粉低劑量組的全血黏度雖低于模型組的，但無顯著差異。表明檸檬汁粉高劑量組可以通過改善血液流變性來抑制血栓的形成。

2.2 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠紅細(xì)胞沉降率的影響

影響血沉速度的因素主要有血漿和紅細(xì)胞，當(dāng)血漿成分或紅細(xì)胞數(shù)量與形態(tài)發(fā)生改變時(shí)，會使紅細(xì)胞間相互排斥而改變血沉速度。血漿中不對稱的大分子物質(zhì)使紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷減少，導(dǎo)致紅細(xì)胞沉降加快；而紅細(xì)胞數(shù)量增多或變形、血漿黏度降低時(shí)，紅細(xì)胞下沉?xí)r受到的阻力增大使血沉減慢[13]。

表1檸檬汁粉對急性血瘀大鼠全血黏度的影響?

Table1TheeffectoflemonjuicepowderonWBVinratswithacutebloodstasis

mPa·s

? **. 與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；##. 與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖1顯示，與正常組相比，模型組大鼠的血沉速率極顯著升高；與模型組相比，檸檬汁粉各劑量組的血沉速率極顯著降低，且高劑量組降低急性血瘀大鼠紅細(xì)胞沉降速率比低劑量組的慢。說明檸檬汁粉有抗血栓的效果。

2.3 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠凝血四項(xiàng)的影響

由表2可知，與正常組相比，模型組大鼠的PT、APTT、TT時(shí)間均顯著延長，而FIB含量顯著降低。與模型組相比，無論是低劑量組還是高劑量組，檸檬汁粉干預(yù)后大鼠的凝血酶原時(shí)間(PT)延長，且高劑量組有顯著差異(P<0.01)，而低劑量組是較顯著差異(P<0.05)；而活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶時(shí)間(TT)均有延長的，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；檸檬汁粉高劑量組大鼠的纖維蛋白原含量(FIB)低于模型組的，但無顯著差異。說明檸檬汁粉主要通過外源性途徑抑制血液凝固，與模型組相比PT時(shí)間分別延長了14.32%和17.78%，具有一定的抗凝活性。

**. 與正常組相比差異顯著(P<0.01) ##. 與模型組相比差異顯著(P<0.01)

圖1 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠血沉的影響

Figure 1 The effect of lemon juice powder on ESR in rats with acute blood stasis

表2 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠凝血四項(xiàng)的影響?

? **. 與正常組相比差異顯著(P<0.01)；#. 與模型組相比差異較顯著(P<0.05)；##. 與模型組相比差異顯著(P<0.01)。

2.4 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠6-酮前列腺素F1α和血栓素B2的影響

6-酮-PGF1α和TXB2分別是前列腺環(huán)素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，其含量高低可以代表PGI2和TXA2的含量高低。PGI2具有抑制血小板聚集和擴(kuò)張血管的作用，而TXA2與之呈生理拮抗作用，能促進(jìn)血小板的聚集和血栓的形成。動脈粥樣硬化、腦血管病變、周圍血管血栓形成及血栓性血小板減少性紫癜等疾病患者，常見6-酮-PGF1α/TXB2比值比較低[14]。

由表3可知，與正常組相比，模型組能極顯著降低6-酮-PGF1α含量，升高TXB2含量，說明急性血瘀大鼠模型造模成功。與模型組相比，阿司匹林組、檸檬汁粉低劑量組和高劑量組大鼠血清中的6-酮-PGF1α含量均極顯著升高，TXB2含量均極顯著降低，兩者比值也極顯著升高。且與阿司匹林組相比，檸檬汁粉高劑量組能極顯著升高6-酮-PGF1α含量，降低TXB2含量的效果也與陽性對照組相當(dāng)。提示檸檬汁粉使TXB2含量減少，6-酮-PGF1α表達(dá)量增加，擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，從而抑制血栓的形成。

2.5 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)和內(nèi)皮素-1(ET-1)的影響

血管在eNOS作用下產(chǎn)生NO，其具有擴(kuò)張血管和抑制血小板功能的作用，而ET-1則是血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴性擴(kuò)張受損的強(qiáng)大血管收縮劑[15]，可通過多種途徑導(dǎo)致血管功能障礙。由表4可知，與正常組相比，模型組能較顯著降低eNOS含量，升高ET-1含量，說明急性血瘀大鼠模型造模成功。與模型組相比，阿司匹林組和檸檬汁粉高劑量組能極顯著升高eNOS含量，而檸檬汁粉低劑量組能升高eNOS含量，但無顯著差異；阿司匹林組和檸檬汁粉低劑量組能較顯著降低ET-1含量，而檸檬汁粉高劑量組大鼠血清中ET-1含量比模型組的低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明檸檬汁粉通過增加eNOS表達(dá)和活性水平，降低ET-1的含量來改善血管功能，從而抑制血栓的形成，且無劑量依賴關(guān)系。

表3 檸檬汁粉對急性血瘀大鼠6-酮前列腺素F1α和血栓素B2的影響?

? **. 與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；##. 與模型組相比差異極顯著(P<0.01)；^^. 與阿司匹林組相比差異極顯著(P<0.01)。

表4檸檬汁粉對急性血瘀大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合成酶和內(nèi)皮素-1的影響?

Table4TheeffectoflemonjuicepowderoneNOSandET-1inratswithacutebloodstasis

組別eNOS含量/(ng·mL-1)ET-1含量/(ng·L-1)正常組 10.53±0.27211.20±21.03模型組 7.49±1.30?263.66±28.28?阿司匹林組 30.13±1.07##218.13±2.52#檸檬汁粉低劑量組9.46±2.12215.76±26.94#檸檬汁粉高劑量組20.22±1.49##231.66±17.52

? *. 與正常組相比差異較顯著(P<0.05)；#. 與模型組相比差異較顯著(P<0.05)；##. 與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬汁粉能降低模型組大鼠全血黏度、減緩紅細(xì)胞血沉速度，提高血液的流動性。凝血系統(tǒng)方面，檸檬汁粉只具有顯著延長PT時(shí)間的作用，對APTT、TT和FIB的影響無顯著差異，主要通過外源途徑調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)，抑制模型大鼠血栓的形成；血管內(nèi)皮損傷方面，檸檬汁粉能提高6-酮-PGF1α和eNOS表達(dá)量，減少模型組ET-1含量，因此推斷檸檬汁粉可能通過修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善血管功能，從而抑制血栓的形成。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)300 mg/kg檸檬汁粉能顯著降低TXB2含量，說明檸檬汁粉能通過減少TXB2釋放，抑制血小板功能，從而改善大鼠血栓形成。

今后需進(jìn)一步針對檸檬汁粉的抗血栓功效成分進(jìn)行深入研究；此外，試驗(yàn)未檢測溶血栓相關(guān)指標(biāo)，對凝血系統(tǒng)中相關(guān)凝血因子表達(dá)的影響等也有待繼續(xù)探索。