克羅諾桿菌主要毒力因子及致病機理研究進展

費 鵬 楊同香 陳 曦 向進樂 趙勝娟 徐云鳳 周蓮昕 郭 鸰 康懷彬

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023； 2. 東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

克羅諾桿菌屬(Cronobacterspp.)原名阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)屬，是食物中重要的條件致病菌之一[1]。早期，阪崎腸桿菌一直被定義為黃色陰溝桿菌(Yellow-pigmentedEnterobactercloacae)，但之后的研究發現在系統發育關系上，黃色陰溝桿菌與陰溝桿菌(Enterobactercloacae)之間存在一定的距離，且兩種病原菌在生理生化特性和抗生素耐受性上也存在顯著差異，因此Farmer等[2]將黃色陰溝桿菌重新命名為阪崎腸桿菌。Iversen等[3]利用分子生物學分析手段對阪崎腸桿菌群體進行了多樣性分析及DNA雜交分析，結果發現試驗所用的阪崎腸桿菌的相似度只有50%以上，相似度小于分類標準中對“種”的定義，因此阪崎腸桿菌被定義為一個新的屬，并命名為克羅諾桿菌屬[4]，并被分為了7個種，分別為阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii)、丙二酸鹽克羅諾桿菌(C.malonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(C.turicensis)、穆汀斯克羅諾桿菌(C.muytjensii)、都柏林克羅諾桿菌(C.dublinensis)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(C.universalis)、康帝蒙提克克羅諾桿菌(C.condimenti)[5]。

大量研究表明克羅諾桿菌能夠污染多種食物，包括水[6]、肉制品[7]、蔬菜[8]、水果[6]、調味品[9]、食用菌[10]和嬰兒食品[11-13]等，嚴重威脅著人們的健康。在2010～2011年各地的疾病預防控制中心的調查報告[14]中，江蘇宿遷對近900份食品樣品進行了克羅諾桿菌的分離鑒定，陽性率為2.6%；在廣西梧州的食品調查中，克羅諾桿菌的檢出率為5.26%，而在湖南長沙食品樣本中克羅諾桿菌的檢出率則高達6.3%?？肆_諾桿菌可通過污染嬰兒配方乳粉(PIF)侵入新生兒的體內，進而產生腸毒素和溶血素，并利用唾液酸通過宿主的血腦屏障，從而造成新生兒的感染[15]。由于克羅諾桿菌嚴重的危害性，對該致病菌毒力因子和致病機理的探索一直是研究的熱點，隨著研究的深入，研究者們從多個角度對克羅諾桿菌的致病機理進行探索。

克羅諾桿菌的致病性為多種因素協同作用的結果，因此其致病機理的揭示是一個復雜的過程。文章結合近年來的相關報道，總結了克羅諾桿菌致病相關的主要毒力因子，并從菌毛的黏附作用、克羅諾桿菌對鐵的吸收作用、對唾液酸的利用能力、生物膜的形成、外排系統、耐干燥能力等方面系統地闡述該病原體的致病機理。

1 克羅諾桿菌主要的毒力因子

1.1 腸毒素

食源性致病微生物普遍具有分泌腸毒素的能力，因此早期的研究致力于克羅諾桿菌腸毒素的相關研究，Pagotto等[16]在克羅諾桿菌發現了一種類似于腸毒素的物質，能與脂多糖協同作用從而引起宿主產生炎癥反應，同時通過腹腔注射和灌胃處理試驗發現小鼠死亡時間不等，說明不同克羅諾桿菌之間的毒力存在差異。隨后，Raghav等[17]發現該腸毒素類似物是分子量為66 kDa的蛋白，經巴氏殺菌處理后仍具有活性，說明乳品加工過程中的簡單熱處理并不能減少該致病菌的污染。綜上，克羅諾桿菌腸毒素的研究在一定程度上揭示該物質的特征，但由于該毒素的基因尚未被確定，因此在食品加工過程中很難針對性地通過抑制編碼毒素基因的表達來減少該致病微生物的污染。

1.2 外膜蛋白

外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)是革蘭氏陰性菌特有的毒力因子，其在克羅諾桿菌侵染宿主腸道上皮細胞和通過血腦屏蔽過程中發揮著重要作用。研究[18-19]發現阪崎腸桿菌和大腸桿菌K1的OmpA在蛋白質水平上達到了88%的相似度，故推測阪崎克羅諾桿菌與大腸桿菌K1的OmpA一樣，在入侵人類腸道上皮細胞的過程中發揮著重要作用，進而通過對腸上皮細胞INT407的侵襲試驗證實了上述推測。Mittal等[20]利用動物試驗探索了OmpA與腦膜炎之間的聯系，研究發現OmpA能與纖連蛋白相結合透過大鼠的血腦屏障損害宿主的中樞神經系統，進而導致腦膜炎的產生。OmpX為另一種與致病相關的外膜蛋白，參與了克羅諾桿菌的基底外側侵襲，同時可轉移至脾臟、肝臟等重要器官[21]。此外，研究[5]發現所有的克羅諾桿菌都能編碼和表達OmpA和OmpX，說明這兩種外膜蛋白并不是造成克羅諾桿菌毒力差異的原因。

1.3 其他毒力因子

隨著轉錄組學和蛋白組學的發展，克羅諾桿菌中一些潛在的毒力因子及其作用被充分挖掘，如表1所示。研究表明，克羅諾桿菌的毒力因子具有多樣性，也說明克羅諾桿菌的致病過程是一個復雜的協同效應，然而此方面的研究還存在一定的局限性，一方面，一些潛在的毒力蛋白雖被發現，但其在克羅諾桿菌致病過程中發揮的作用尚未被揭示；另一方面，目前的研究一般都是以一種毒力基因為靶點，忽視了毒力因子之間的協同作用，因此后續可針對毒力因子的協同作用進行研究。

2 克羅諾桿菌的致病機理

2.1 菌毛的黏附作用

克羅諾桿菌對宿主的侵染作用首先取決于其較強的黏附能力，而研究[26]發現細菌的菌毛能夠幫助菌體吸附于受體細胞表面，從而有助于克羅諾桿菌侵染宿主。研究[27-28]發現與膿血癥和敗血癥有關的纖維菌毛基因并未在阪崎克羅諾桿菌中發現，卻存在于蘇黎世克羅諾桿菌基因組中，表明蘇黎世克羅諾桿菌能引起宿主的膿血癥和敗血癥與纖維菌毛的存在密切相關。此外，據報道[29]阪崎克羅諾桿菌P菌毛能夠促進新生兒腦膜炎的發生，IV型菌毛則與該致病菌的黏附作用密切相關。上述研究表明克羅諾桿菌菌毛的黏附作用不僅能夠提高其對宿主的侵染能力，而且與克羅諾桿菌的致病類型密切相關，因此可以通過抑制調控菌毛表達的基因，降低該致病菌對宿主的侵染能力。

表1 克羅諾桿菌其他的毒力因子

2.2 克羅諾桿菌對鐵的吸收作用

鐵作為一種重要的酶輔因子參與了細菌的大量生命活動，因此細菌對鐵的吸收能力被認為是病原菌感染宿主的基礎[30]。研究[31]發現克羅諾桿菌的毒力質粒中含有特異的毒力因子——鐵捕獲系統，該系統與纖溶酶原激活物以及絲狀血凝素一起參與該致病菌對宿主的侵染。pESA3和pCTU1質粒中均含有iucABCD/iutA和eitCBAD兩個鐵吸收系統，并編碼了一系列的毒力因子，說明鐵吸收系統與克羅諾桿菌的致病性密切相關[32]。此外，通過全基因組測序[33]發現在阪崎克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌中發現了編碼pESA3和pCTU1質粒的基因，而在克羅諾桿菌屬中的阪崎克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌被證實有侵染機體的能力，說明克羅諾桿菌對鐵的吸收作用在其致病過程中發揮著重要作用。

2.3 克羅諾桿菌對唾液酸的利用能力

唾液酸是神經節苷脂的重要組成部分，能夠確保新生兒大腦的正常發育，尤其是對體重較輕的新生兒，可以通過提高體內唾液酸的含量促進其腦結構和功能的健康發育[34]。PIF是嬰幼兒獲得唾液酸的主要途徑，唾液酸的攝取能夠提高新生兒腸道內N-乙酰葡糖胺殘基的含量，從而達到促進腸道中有益微生物增殖并抑制有害微生物生長的目的[35]。然而阪崎克羅諾桿菌卻具有利用唾液酸的能力，是阪崎克羅諾桿菌可以順利定值于新生兒腸道中，并能夠穿透血腦屏障誘發新生兒腦膜炎的重要原因之一[36]。目前，在克羅諾桿菌的7個種中，只有阪崎克羅諾桿菌的全基因組中含有編碼利用唾液酸的基因簇nanAKT，闡明了為何阪崎克羅諾桿菌是分離自PIF及新生兒腦膜炎臨床樣本的優勢菌群[37-38]?？肆_諾桿菌對唾液酸的利用能力增加了新生兒感染腦膜炎的風險，科學地對PIF進行沖調有利于減少被污染的PIF進入體內?？肆_諾桿菌對熱較為敏感，因此可采用70 ℃左右的熱水對PIF進行沖調，即便PIF已經被該致病菌污染也能達到防止新生兒被感染的目的。

2.4 生物膜的形成

克羅諾桿菌的生物膜能夠提高該致病菌的吸附能力，并在一定程度上起到自我保護的作用，從而提高了其在不良環境中的生存能力[39]。在克羅諾桿菌中黏附素蛋白ESA_00281和ESA_00282已被證實參與了生物膜的形成，并與該致病菌的黏附能力密切相關[40]。莢膜異多糖是克羅諾桿菌生物膜的主要成分，能夠使克羅諾桿菌更好地吸附在硅膠、不銹鋼、塑料、玻璃及木質案板上，從而促進該病原體抵抗外界不良的環境[41]。在PIF的生產過程中，包裝被認為是克羅諾桿菌最易污染的環節，與克羅諾桿菌具有形成生物膜的能力密切相關。生物膜的形成可促進克羅諾桿菌緊密地吸附在包裝材料上，并能夠提高該致病菌對消毒劑的抵抗能力，最終提高克羅諾桿菌感染嬰幼兒的幾率。

2.5 外排系統

主動外排系統是一種公認的致病性機制，有助于致病微生物在宿主胃腸道中存活[42]。克羅諾桿菌中存在編碼銅銀陽離子外排系統的基因ibeB(與cusC同源)，該基因可介導克羅諾桿菌侵襲大腦微血管內皮細胞[43]。同時研究[44]發現可引起新生兒感染的克羅諾桿菌菌株中存在完整的陽離子外排操縱子及調節因子，而非感染性菌株中缺失或不存在上述毒力因子。可見，克羅諾桿菌的外排系統與其致病能力有著密切的聯系，因此可以編碼陽離子外排操縱子或者調節因子的基因為靶點，結合轉錄組學和蛋白質組學挖掘克羅諾桿菌潛在的毒力因子，從而深入地揭示克羅諾桿菌的致病機理。

2.6 耐干燥能力

克羅諾桿菌對食品尤其是對PIF的污染已備受重視，該病原體是腸桿菌科中耐干燥和耐滲透壓能力最強的屬，也是由于這一特性使得克羅諾桿菌能夠在水分活度極低的PIF中長期存活[45]。大多數克羅諾桿菌可以在水分活度(Aw)0.2～0.5的條件下存活1年以上，而一些具有膠囊結構的克羅諾桿菌菌株則可在干燥的環境中存活2.5年以上，大大增加了該致病菌侵染嬰幼兒的幾率[46]。研究[47]發現克羅諾桿菌強的耐干燥能力是由于其細胞液中含有大量的海藻糖，提高了克羅諾桿菌細胞的滲透壓，從而增強了該致病菌的抗干燥能力。此外，在牛奶瓊脂培養基中具有膠囊結構莢膜的克羅諾桿菌能夠產生高黏度的液體，與克羅諾桿菌的毒素特征和抗干燥能力密切相關[48]。上述研究表明，強的耐干燥能力使得克羅諾桿菌能夠在干燥的環境下長期存在，與其他腸桿科微生物相比，克羅諾桿菌能夠穩定地存在于PIF中。

3 結論

克羅諾桿菌是PIF中的A類致病菌，新生兒和嬰幼兒一旦攝入被該致病菌污染的PIF即會造成嚴重的感染，甚至危及生命[49]。目前，對于克羅諾桿菌引起的新生兒感染并未得到應有的重視，比如在阜陽毒奶粉事件中，起初新生兒腦膜炎被認為是由于奶粉中蛋白質含量過低造成的，但隨后的研究[50]發現毒奶粉中克羅諾桿菌的污染率高達12.6%，表明克羅諾桿菌污染很可能是造成“大頭娃娃”事件最重要的原因，因此開展克羅諾桿菌毒力因子和致病機理的研究是非常必要的。

近年來，對于克羅諾桿菌致病性的研究逐漸深入，并取得了一定的進展，同時也存在以下問題：① 目前的研究大多集中在某單一的毒力因子，而克羅諾桿菌的致病能力是多種毒力因子共同作用的結果，因此現有研究并不能清晰地揭示克羅諾桿菌的致病機理，但隨著組學技術的發展，越來越多的毒力因子終將被發現；② 在致病機理的研究過程中，目前的研究通常以某一基因(蛋白)為靶點，并未形成一個完整的調控網絡，為克羅諾桿菌致病機理的研究造成了障礙；③ 細菌并不是以個體存在的，會通過分泌信號因子影響群體的行為，已有研究[51]表明這種群體感應與細菌生物膜的形成和毒素的表達密切相關，因此克羅諾桿菌的群體感應系統與其致病性的關系還需深入研究。