響應面法優化制備牡蠣短肽工藝

柏昌旺，章超樺,2,3,4,5，林海生,2,3,4,5，秦小明,2,3,4,5，曹文紅,2,3,4,5，楊雨柔

響應面法優化制備牡蠣短肽工藝

柏昌旺1，章超樺1,2,3,4,5，林海生1,2,3,4,5，秦小明1,2,3,4,5，曹文紅1,2,3,4,5，楊雨柔1

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518120；3. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室// 4. 廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室// 5.國家貝類加工技術研發分中心（湛江），廣東 湛江 524088）

探究前處理方式對酶解效果的影響，優化牡蠣短肽制備工藝。在確定高效酶種類和前處理方式的基礎上，以氮回收率、短肽得率為指標對酶解時間、料液比、酶解溫度、加酶量進行單因素試驗，再利用響應面設計建立數學模型，以短肽得率為響應值，進行4因素3水平的響應面分析。牡蠣經80 ℃熱處理10 min后使用動物蛋白酶的酶解效果最佳。響應面結果顯示，最佳酶解工藝為料液比（g/mL）1∶3.9、溫度47 ℃、加酶量3 300 U/g、自然pH（6.5）、酶解3 h，其短肽得率為（58.53 ± 1.20）%，比原酶解工藝提高24.8%。

牡蠣；短肽；可控酶解；響應面法

牡蠣俗稱生蠔、海蠣子，因肉質爽滑，味道鮮美，營養豐富，被附以“根之源”“海洋牛奶”等美譽[1]。近年來，我國牡蠣行業產量呈現逐年上升的趨勢，2018年養殖量達513.9萬t[2]。但是目前國內牡蠣的應用仍以直接食用或制成調味料為主，針對其精深加工技術與新型產品開發的進展較為緩慢，因此，推動牡蠣深加工及綜合利用對其產業的可持續發展具有十分重要的意義[3]。一般來說，3 ~ 9個氨基酸聚合而成的肽稱為短肽，其相對分子質量范圍為180 ~ 1 000，介于氨基酸與蛋白質之間，具有吸收好、代謝快、活性高等優點，是目前國內外研究開發的熱點[4]。牡蠣短肽具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗凝血、抗炎癥、改善學習記憶[5-11]等多種生物活性。但現階段牡蠣肽的傳統制備工藝普遍存在短肽得率低，酶解后的超濾和分離純化工藝復雜、富集困難等問題[12]，直接阻礙了其產業化發展。目前急需一種高效制備牡蠣短肽的工藝。

蛋白質的可控酶解是指通過控制水解條件、水解度的方法而獲得目標分子量分布的水解產物[13]，但現階段可控酶解技術只應用于提高功能物質的活性，對如何控制、富集目標分子量產物研究尚未見有報道。本研究利用可控酶解技術水解牡蠣，研究不同蛋白酶、前處理方式對酶解效果的影響，在單因素的基礎上采用響應面法確定酶解牡蠣的最佳工藝，為牡蠣可控酶解短肽的制備工藝及規?；a提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣（），體質量（20.56 ± 1.34）g，購于湛江市東風市場；菠蘿蛋白酶（1.6×104U/g）、木瓜蛋白酶（7.0×104U/g）、動物蛋白酶（6.8×104U/g）、風味蛋白酶（7.0×104U/g）、中性蛋白酶（6.3×104U/g），南寧龐博生物工程有限公司；Protamex（6.3×104U/g）、Flavourzyme（5.9×104U/g），諾維信生物技術有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH），上海源葉生物有限公司；混合氨基酸標準溶液，和光純藥工業株式會社；氫氧化鈉、甲醛等分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-25雷磁pH計，上?？祪x儀器有限公司；UV-8000 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；VAPODEST450 全自動凱氏定氮儀，德國Gerhardt公司；L-8900全自動氨基酸分析儀，日立高新技術公司；SHZ-水浴恒溫震蕩器，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；冷阱CT-6、ZLS-1型真空離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備 牡蠣全肉經流水解凍后打漿均勻，按料液質量體積比（g/mL，下同）1∶3加水，調各酶最適pH值，8 000 r/min勻漿2 min，加酶酶解后100 ℃水浴滅酶10 min，靜置冷卻至室溫后以8 000 r/min離心15 min，最后四層紗布過濾獲取上清液，在-20 ℃下保存備用。

1.3.2 高效蛋白酶的篩選 選用Flavourzyme、Protamex、動物蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，在各自最適條件下進行酶解（表1），以水解度、氮N回收率、短肽質量濃度、短肽得率為指標綜合評價酶解效果。

表1 各酶酶解條件

Table 1 Enzymatic conditions of each enzyme

1.3.3 前處理對酶解效果的影響 稱取牡蠣漿液40 g放入250 mL錐形瓶中，按料液比1∶3加蒸餾水后均質，分別采用熱處理（60、70、80、90、100 ℃下水浴保溫10 min）和室溫25 ℃下超聲波處理（功率500 W處理10、15、20 min，）兩種方式對牡蠣勻漿液進行預處理，冷卻至室溫測pH值后加入動物蛋白酶酶解4 h，最后100 ℃水浴滅酶10 min離心取上清液，-20 ℃冷凍保存備用。

1.3.4 單因素試驗 在篩選出最佳蛋白酶和前處理方式的基礎上，探究酶解時間、料液比、溫度、加酶量對短肽得率和N回收率的影響。酶解時間：在加酶量為3 000 U/g、溫度50 ℃、料液比1∶3、自然pH條件下分別酶解1、2、3、4、5 h。料液比：在加酶量為3 000 U/g、溫度50 ℃、酶解時間3 h、自然pH條件下料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。酶解溫度：在加酶量為3 000 U/g、料液比1∶4，酶解時間3 h、自然pH條件下酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃。加酶量：在酶解溫度45 ℃、料液比1∶4、酶解時間3 h、自然pH下加酶量分別為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g。

1.3.5 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken實驗設計原理，以酶解時間（）、料液比（）、酶解溫度（）、加酶量（）四個因素為自變量，短肽得率為響應值，采用軟件Design-Expert V8.0.6.1設計四因素三水平的響應面分析試驗優化酶解條件，相應因素與水平設計如表2所示。

表2 響應面試驗因素與水平

Table 2 Response surface test factors and levels

1.3.6 指標測定

1.3.6.1 水解度的測定 原料中總氮量和非蛋白氮量采用凱氏定氮法[14]，水解液中氨基態氮量和原料中游離的氨基態氮量采用中性甲醛電位滴定法[15]。水解度（DH）計算公式如下：

1.3.6.2 蛋白質回收率的測定 蛋白質回收率= 上清液總蛋白質含量/ 底物總蛋白質含量。

1.3.6.3 短肽質量濃度的測定 參考徐倩等[16]的方法略有改動。標準曲線的繪制：首先配制10 mg/mL的GSH溶液，然后將其稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL的10種不同濃度的標準溶液。取2 mL標準溶液與3 mL的雙縮脲試劑混勻，于漩渦混合儀上混合均勻，60 ℃水浴10 min后于540 nm 下測定光密度值。以標準肽濃度為橫坐標（mg/mL），各濃度相應的吸光值為縱坐標，制作一定濃度范圍內的標準曲線。

樣品測定：取牡蠣酶解液4 mL，加入4 mL體積分數10%的三氯乙酸（TCA）溶液，在旋渦混合儀上混合均勻后靜置10 min，然后4 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋倍后，取2 mL加入雙縮脲試劑3 mL [(樣液)∶(雙縮脲試劑) =2∶3]，于漩渦混合儀上混合均勻，60 ℃水浴10 min取上清液于540 nm下測定光密度值，對照標準曲線求得樣品溶液中的短肽質量濃度(mg/mL)。

1.3.6.4 短肽得率的測定[17]

短肽得率= （·）/，

式中：為樣品溶液中短肽質量濃度(mg/mL)；為10% TCA總體積（mL）；為樣品蛋白質質量（g）。

1.3.7 數據分析 采用Design Expert 8.0.6.1軟件對響應面數據進行分析，EXCEL 2016、Origin 9.0進行數據分析，SPSS 23進行數據顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解效果分析

圖1A所示，風味蛋白酶的水解度最高為（41.86 ± 3.62）%，動物蛋白酶略低，為（41.37 ± 1.19）%，兩者無顯著差異（> 0.05）。中性蛋白酶的N回收率最高為（84.12±2.18）%，動物蛋白酶次之為（77.53 ± 0.49）%。由圖1B顯示結果可知，動物蛋白酶的短肽質量濃度和短肽得率均顯著高于其他六種蛋白酶（< 0.01），分別為（15.68 ± 0.67）mg/mL，34.79%。不同蛋白酶的酶切位點千差萬別導致酶解效果的大不相同，動物蛋白酶本身是一種復合酶，它既是內切酶又是外切酶，具有多種酶切位點，故其酶解產物各項指標利用率高。因此，選取動物蛋白酶為酶解牡蠣的高效蛋白酶，進行下一步實驗。

凡有一個標記相同字母即為差異不具統計學意義（> 0.05）

The same letter means no statistically significant difference (>0.05)

圖1 不同蛋白酶之間的酶解效果比較

Fig.1 Comparison of enzymatic hydrolysis between different proteases

2.2 不同前處理對酶解效果的影響

由圖2A可知，熱處理10 min后的動物蛋白酶酶解產物水解度和N回收率均低于未處理，且隨著溫度升高，牡蠣酶解產物的水解度和N回收率逐步降低。這可能是因為加熱溫度過高或時間過長，都會使已暴露出來的S—H氧化生成S—S或疏水相互作用導致致密的網狀結構形成，導致眾多酶切位點反而被包埋[18]。郭玉華等研究顯示熱處理溫度越高，牡蠣酶解產物的水解度越低[18]；林海生等研究表明熱處理組水解度均低于未處理組[19]。本研究結果與其結論相一致。圖2A顯示，酶解產物在500 W條件下超聲10、15、20 min后的水解度和N回收率均低于未處理組。這可能是500 W超聲波過強且超聲波過程中產熱導致牡蠣蛋白質結構被破壞，致使蛋白酶酶解效率降低。這與郭玉華的研究結果相一致[19]。

由圖2B結果所示，超聲波組的短肽質量濃度、短肽得率均低于未處理組。熱處理組的兩項指標在60~80℃時隨溫度增長呈現明顯的上升趨勢，在80℃時短肽得率達到最高，為（43.25 ± 0.56）%，之后增長趨勢較為平緩，90 ℃時甚至略有下降。100 ℃時的短肽質量濃度最高，為（21.06 ± 0.27）mg/mL，與80 ℃的短肽質量濃度（20.79 ± 0.27）mg/mL無顯著性差異（>0.05）。溫度升高使得短肽含量升高，可能是因為熱處理雖導致部分酶切位點被包埋，使酶解產物體系中水解度和N回收率顯著下降，但與未處理相比，熱處理使更多隱藏的內切位點暴露，蛋白酶得以作用于肽鏈內部，從肽鏈中間切斷，迅速降低蛋白質分子量，使短肽得率上升。這說明熱處理對短肽的生成是個有效推進的過程。綜合評定，選擇將80 ℃熱處理10 min后的牡蠣酶解液進行下一步實驗。

凡有一個標記相同字母即為差異不具統計學意義（> 0.05）

The same letter means no statistically significant difference (>0.05)

圖2 不同前處理方式對酶解效果的影響

Fig. 2 Effect of different pretreatment methods on enzymatic hydrolysis

2.3 單因素試驗

2.3.1 酶解時間的確定 由圖3所示，隨著酶解時間的增長，N回收率逐步增加，在3 h后無顯著性變化（>0.05）。短肽得率先上升后下降，3 h時有最高值，這主要是因為反應初期，底物濃度高，蛋白質迅速被酶解成肽和氨基酸，隨著時間的延長，肽被切割成分子量更小的氨基酸導致短肽含量的下降。因此，酶解時間選擇3 h為宜。

圖3 酶解時間對短肽得率和N回收率的影響

2.3.2 料液比的確定 由圖4可知，隨著料液比增加，短肽得率和N回收率呈現先增大后減小的趨勢，在1∶4時出現峰值。這是因為一般情況下作為溶質的底物蛋白質濃度過高，會減低分子間的擴散，導致酶與底物接觸面積減少，對酶解產生抑制作用。此后當料液比增加到一定程度時會降低底物濃度，減少酶與底物接觸幾率，使酶解作用減弱[20]。因此，料液比選擇1∶4為宜。

圖4 料液比對短肽得率和N回收率的影響

2.3.3 酶解溫度的確定 由圖5可知，隨著溫度的升高，短肽得率和N回收率先升高后下降，45 ℃時出現峰值，且顯著高于（<0.01）其他溫度下的酶解效果。這是因為在一定溫度范圍內，酶活力會隨著溫度上升而升高；最適溫度時，酶的催化反應速率最快；當溫度過高時，酶蛋白會逐步發生變性作用，影響酶的催化活力導致酶解效果降低。因此，酶解溫度選擇45 ℃為宜。

圖5 酶解溫度對短肽得率和N回收率的影響

2.3.4 加酶量的確定 由圖6所示，加酶量在1 000 ~ 3 000 U/g時，短肽得率與N回收率升高迅速。酶量再增加時，短肽得率有所降低，分析可能是由于酶與底物反應過于充分，導致部分短肽被酶解成氨基酸。N回收率在加酶量為4 000 U/g時略有降低，但加酶量5 000 U/g時仍有所提高，但與3 000 U/g無顯著性差異（> 0.05）?？紤]到生產成本，選擇加酶量3 000 U/g最為適宜。

圖6 加酶量對短肽得率和N回收率的影響

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面試驗結果與分析 根據單因素實驗結果，設計以短肽得率為響應值，酶解時間（）、料液比（）、酶解溫度（）、加酶量（）四個因素為自變量的響應面試驗方案，試驗方案和結果如表3所示。

表3 響應面試驗方案與結果

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對響應面模型進行分析，得出短肽得率（）與各因素變量的二次多項回歸方程為：= 57.48 + 0.46- 0.26+ 3.43+ 1.69- 0.035- 0.073- 0.17+ 0.16+ 0.16- 0.40- 2.082- 0.832- 4.582- 2.582。對方程進行顯著性檢驗方差分析及可信度分析，結果分別如表4和表5所示。

由表4可知，短肽得率回歸模型< 0.000 1，說明該模型極顯著。一次項、，二次項2、2、2呈現為極顯著，2為顯著。由值可以看出，在4個因素中，對短肽得率影響最大的因素是酶解溫度（），其次分別是加酶量（）、酶解時間（），影響最小的是料液比（），其中，失擬項= 0.074 8 > 0.05，為不顯著，說明方程模擬較好，可以很好的分析數據。由表5可知，模型擬合系數R= 0.991 2，模型校正擬合系數2adj= 0.959 1，表示該模型能夠解釋短肽得率95.91%的變化來自于所選變量。同時變異系數為1.35%，說明模型置信度高，可以準確預測和分析四個變量對酶解制備牡蠣短肽得率高低的影響。

表4 二次回歸方程的顯著性檢驗及方差分析

注：*表示差異顯著（< 0.05）；**表示差異極顯著（< 0.01）

表5 二次回歸方程的可信度分析

2.4.2 響應面3D模型分析 由圖7可知，a ~ f的三維圖形均呈現凸面且開口向下，響應面中心點處于變量范圍內，說明短肽得率在兩因素交互作用中有最大值。圖7b與圖7f中，隨著因素的改變，短肽得率呈現先增加后減低的趨勢，且曲面相對較為陡峭，等高線密集成橢圓形，但圖形中的時間-溫度、加酶量-溫度的交互作用不顯著。其他圖形的變化趨勢與之相似，交互作用均不顯著。

圖7 時間、料液比、加酶量、溫度四因素兩兩交互作用三維分析

2.4.3 驗證實驗 以短肽得率為響應值，利用軟件分析獲得最佳酶解工藝條件為料液比1∶3.9，酶解溫度46.78 ℃，加酶量3 296.8 U/g，酶解時間3.04 h，自然pH，此時的短肽得率為58.37%。考慮實際操作的可行性，將工藝條件調整為料液比1∶3.9，酶解溫度47 ℃，加酶量3 300 U/g，酶解時間3 h，自然pH，在此條件下進行3次實驗的短肽得率為（58.53 ± 1.20）%，與預測值接近且無顯著性差異（> 0.05），說明該二次項回歸方程能準確預測可控酶解制備牡蠣短肽。且該工藝比傳統工藝短肽得率提升24.8%[21]。

3 結論

本實驗確定牡蠣勻漿液經80 ℃熱處理10 min后加動物蛋白酶為制備牡蠣短肽的高效方法。確定最佳酶解工藝條件,即料液比1∶3.9，酶解溫度47 ℃，動物蛋白酶加酶量3 300 U/g，自然pH下酶解時間3 h，此條件下短肽得率達（58.53 ± 1.20）%，比傳統工藝的短肽得率提升24.8%。該回歸模型可靠，說明利用響應面法能有效優化制備牡蠣短肽的酶解工藝。

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Optimization of Preparation Process of Oyster Oligopeptides by Response Surface Methodology

BAI Chang-wang1, ZHANG Chao-hua1,2,3,4,5, LIN Hai-sheng1,2.3,4,5,QIN Xiao-ming1,2,3,4,5, CAO Wen-hong1,2,3,4,5,YANG Yu-rou1

(1.,524088,; 2.,18120,;3.// 4.//5.(),520488,）

To explore the effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis and optimize the preparation of oyster oligopeptides.Based on the screening of protease and the confirmation of the pretreatment method, the effects of hydrolysis time, solid-liquid ratio, enzymatic temperature, enzyme-to-substrate ratio on the oligopeptides yield and N recovery rate were investigated. Then mathematical models were set up by response surface methodology. With oligopeptides yield as the response values, the four-factor and three-level response surface analysis was set up.The results showed that animal protease was found to be more suitable for the preparation of oligopeptides from oyster with a pretreatment by heating at 80℃for 10 min. The response surface showed the optimal enzymatic hydrolysis which included hydrolysis temperature at 47 ℃, solid to liquid ratio of 1:3.9, enzyme addition amount of 3300 U/g protein and enzymatic hydrolysis for 3 h under natural conditions with unregulated pH(6.5). Under these conditions, the yield of oligopeptides was 58.53%±1.20%, which was 24.82% higher than that of the traditional enzymatic hydrolysis process.

oyster; oligopeptides; controllable enzymatic hydrolysis; response surface analysis

TS254.4

A

1673-9159（2019）06-0085-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.011

2019-08-16

廣東省應用型科技研發專項資金項目（2016B020235002）；貝類產業技術體系建設專項（CARS-49）；廣東普通高等學校水產品高值化加工與利用創新團隊項目（GDOU2016030503）；海洋貝類營養健康食品關鍵技術及產業化（GDOU2017052606）

柏昌旺（1995—），男，碩士研究生，研究方向為水產品高值化加工與利用。E-mail:1029537824@qq.com

章超樺（1956—），男，教授，博士，研究方向為海洋生物資源綜合利用。E-mail:zhangch2@139.com

柏昌旺，章超樺，林海生，等. 響應面法優化制備牡蠣短肽工藝[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（6）：85-92.

（責任編輯：劉朏）