氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏期間理化指標變化及優勢腐敗菌的分離鑒定

李德紅 祝傳海 岳曉霞 王璇 呂云雄 劉俊杞 張根生

摘 要：為研究氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏條件下貯藏品質的變化，將未加抑菌劑的氣調包裝醬鹵鴨食管在冷藏（0～4 ℃）條件下貯存12 d，分別測定其pH值、水分活度、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值、感官評分及微生物菌相等指標的變化。結果表明：隨著冷藏時間的延長，氣調包裝醬鹵鴨食管的感官品質顯著降低、pH值顯著下降，而TBARs值呈顯著上升趨勢，水分活度呈下降趨勢，但下降幅度很小;將分離純化后的腐敗菌采用16S rDNA測序方法進行鑒定，發現冷藏條件下氣調包裝醬鹵鴨食管中的優勢腐敗菌主要有副黃假單胞菌、特基拉芽孢桿菌、肉芽腫克雷伯氏菌和香坊腸桿菌。

關鍵詞：氣調包裝;醬鹵鴨食管;理化指標;優勢腐敗菌

Abstract： In order to study the quality changes of modified atmosphere-packaged （MPA） sauced duck esophagus under cold storage conditions， MPA sauced duck esophagus without any antimicrobial was stored under refrigeration （0–4 ℃） for 12 days. Changes in pH value， water activity， thiobarbituric acid reactive substance （TBARs） value， sensory evaluation score and microbial flora were determined during the storage period. The results showed that with the prolongation of storage time， the sensory quality of MPA duck esophagus decreased significantly， and so did the pH value. In addition， the TBARs value showed a significant upward trend， while the water activity decreased but only slightly. The dominant spoilage bacteria in MPA sauced duck esophagus were Pseudomonas parafulva， Bacillus tequilensis and Klebsiella granulomatis and Enterobacter xiangfangensis， as identified by 16S rDNA sequencing.

Keywords： modified atmosphere packaging; sauced duck esophagus; physicochemical indicators; dominant spoilage bacteria

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149

中圖分類號：TS251.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）09-0059-05

引文格式：

李德紅， 岳曉霞， 張根生， 等. 氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏期間理化指標變化及優勢腐敗菌的分離鑒定[J]. 肉類研究， 2019， 33（9）： 59-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190626-149. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

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鴨食管又名鴨郡把、鴨胰胃，位于鴨胗和鴨食帶連接的位置，其風味獨特、營養價值高，深受我國消費者的喜愛，是我國傳統食材之一[1-2]。醬鹵鴨食管屬于低溫肉制品，一般為散賣，這制約了其貯藏期間的品質和貨架期穩定性[3]。目前針對醬鹵鴨肉制品的研究主要集中在工藝參數優化和貯藏品質研究[4-5]，對于其優勢腐敗菌的分離鑒定方面的研究尚需完善，尤其是對于醬鹵鴨食管的研究鮮有報道。

氣調包裝是指通過調節食品包裝環境氣體的構成來延長食品壽命和貨架期的一種食品包裝技術[6-7]。氣調保鮮技術在果蔬保鮮中的應用比較廣泛，但現在也開始應用于肉類、水產品及焙烤食品等方便食品保鮮[8]。氣調保鮮肉類產品有較長的保鮮期和貨架期，較好地保持了肉類原有的品質、色澤、風味、口感及營養，提升了肉類產品的食用價值。

在不同溫度條件下，食品的理化指標和菌相結構隨貯藏時間的延長均會發生很大變化。李鳴等[9]研究不同貯藏溫度對氣調包裝白切雞pH值、色度、貯藏損失等理化指標以及微生物指標的影響，結果表明，4 ℃冷藏能有效延長該產品的貨架期。劉子宇等[10]采用基礎培養基及多種選擇性培養基，分離篩選和初步鑒定普通冷卻豬肉中的主要微生物菌群，結果表明，可能引起冷卻豬肉腐敗的微生物主要包括李斯特氏菌屬、腸桿菌科、假單孢菌屬、乳酸菌屬（主要是乳酸球菌）及熱殺索絲菌屬。

本研究主要對冷藏期間氣調包裝醬鹵鴨食管的理化指標變化及優勢腐敗菌的分離鑒定進行研究，為氣調包裝醬鹵鴨食管保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碘乙酸鈉（分析純） 西隴化工股份有限公司;氯化鉀（分析純） 天津市大陸化學試劑廠;三氯乙酸（分析純） 天津歐博凱化工有限公司;硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）（分析純） 天津市新精細化工開發中心。

1.2 儀器與設備

TG16-WS高速離心機 黑龍江嘉禾廣博進出口有限公司;CS-800色差儀 杭州彩譜科技有限公司;V-5000分光光度計 上海元析儀器有限公司;DHP-9082恒溫培養箱 上海百典儀器設備有限公司;HBD5-MS2123Wa水分活度測試儀 北京金洋萬達科技有限公司;LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;AV-608全自動復合氣調包裝機 蘇州德森包裝機械有限公司;Sartorious-PB-10 pH計 廣州市深華生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣調包裝醬鹵鴨食管的制作

原料經過焯水至斷生后用老湯鹵煮1 h，鹵煮后的鴨食管在冷卻室（4 ℃）冷卻，切割成5～6 cm后裝盒，經氣調包裝后，于冷藏（0～4 ℃）條件下貯存12 d。氣調包裝條件為75%氮氣+25%二氧化碳。

1.3.2 pH值測定

參照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》[11]，并稍作改動。稱取10 g醬鹵鴨食管肉樣，將其剪碎，加入90 mL pH值測定液（5 mmol/L碘乙酸鈉與0.15 mol/L氯化鉀混合液）搖勻，在室溫條件下用校準后的pH計進行測定[12]。

1.3.3 水分活度測定

參照GB 5009.238—2016《食品安全國家標準 食品水分活度的測定》[13]。

1.3.4 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值測定取10 g剪碎后的醬鹵鴨食管，加入25 mL 25%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），再加入20 mL蒸餾水，高速均質30 s，3 000 r/min離心20 min后用濾紙過濾;取上清液2 mL，加入2 mL 0.02 mo1/L TBA，沸水浴20 min，流水冷卻5 min后在532 nm波長處測定吸光度;取25 mL 25% TCA，加入20 mL蒸餾水，取混合液2 mL再加入2 mL TBA作為空白對照[14-15]。

1.3.5 感官評定

采用定量描述性分析方法對醬鹵鴨食管進行感官評定。采用9 cm線性尺度為評分標尺，10 名品評員參照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規范》[16]和姚來斌等[17]方法中的感官評分要求對樣品的色澤、口感、氣味、風味、組織狀態及總體可接受度進行評分。最高分為9 分，最低分為1 分。醬鹵鴨食管的感官評價標準見表1。

1.3.6 菌落總數測定

參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[18]。

1.3.7 氣調包裝醬鹵鴨食管中優勢腐敗菌的分離鑒定

將介于腐敗和未腐敗臨界點之間的氣調包裝醬鹵鴨食管按菌落總數測定方法進行梯度稀釋，選擇3 個合適的稀釋度，傾注于各培養基，每個稀釋度重復5 次，30 ℃培養72 h，選取菌落總數30～300 個的平板[19]。通過菌落形態特征觀察和生理生化實驗，進行菌株的篩選分組，挑取單菌落進行斜面培養、編號，然后采用不同的培養基平板進行純化。得到的純種菌株制成甘油菌懸液，于-80 ℃超低溫冰箱中保藏。

將超低溫保藏的菌株進行活化，并用酚/氯仿抽提法提取其基因組DNA[20]，采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進行16S rRNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR反應體系總體積25 ?L，包括DNA模板2.0 ?L、正反向引物各0.6 ?L（0.2 ?mol/L）、Taq酶1 ?L、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1.6 ?L、Mg2+ 1.5 ?L，加重蒸水至25 ?L。PCR擴增參數設置為：94 ℃預變性4 min后，按照94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min進行28 個循環，最后于72 ℃延伸10 min。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測符合測序要求，對擴增產物進行測序。將獲得的序列在Ez Taxon server 2.1軟件中進行比對分析，獲得初步鑒定結果。用MEGA 6.0軟件進行系統進化樹構建，從而獲得菌群結構和功能信息[21]。

1.4 數據處理

所得數據均為3 次實驗的平均值，使用Statistix 7.0軟件中的Linear Models程序進行數據統計分析，使用單因素方差分析進行數據差異顯著性分析（P<0.05），利用Origin 8.0軟件（美國Microcal公司）繪制折線圖。

2 結果與分析

2.1 氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中pH值的變化小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。下同。

由圖1可知：在冷藏條件下，氣調包裝醬鹵鴨食管pH值呈顯著下降趨勢（P<0.05），變化范圍為5.8～6.0，且下降趨勢較平緩;冷藏10 d時，醬鹵鴨食管pH值大幅降低，結合感官評價得到，產品品質急劇下降;冷藏初期，醬鹵鴨食管的pH值為5.99，冷藏末期降為5.81。結合醬鹵鴨食管中優勢腐敗菌分離鑒定結果及包裝環境分析，其pH值下降可能是微生物發酵糖類或包裝內的CO2溶解在鴨食管內形成碳酸類物質產酸造成的[22-23]。

2.2 氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中水分活度的變化

由圖2可知：氣調包裝醬鹵鴨食管的初始水分活度接近1.000，水分活度大于0.9非常有利于微生物的生長繁殖;隨著冷藏時間的延長，醬鹵鴨食管會由于氧化析出一部分水分[24]，但是由于醬鹵鴨食管的冷藏環境是無氧且低溫的，因此其水分活度呈下降趨勢（P<0.05），但下降幅度較小，在12 d的冷藏期內，其水分活度始終處于0.980～1.000之間。

2.3 氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中TBARs值的變化

由圖3可知：隨著冷藏時間的延長，氣調包裝醬鹵鴨食管TBARs值呈上升趨勢，且差異顯著（P<0.05）;氣調包裝醬鹵鴨食管初始TBARs值約為0.1 mg/kg，貯藏末期為0.4 mg/kg左右，雖然沒超過0.5 mg/kg，未能使脂肪出現哈喇味，但也表明產品脂肪在貯藏過程中發生了氧化。

2.4 氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中感官品質的變化

由圖4可知，冷藏1～7 d時，氣調包裝醬鹵鴨食管的感官評分呈下降趨勢，貯藏時前期的感官品質下降較緩慢，隨著冷藏時間的延長，氣調包裝醬鹵鴨食管的感官品質一直比較穩定，但是由于產品水分及蛋白質含量較高，貯藏后期由于蛋白質變質及微生物繁殖產酸導致產品出現令人不愉快的酸臭味[25-26]，產品表面也有發黏滲水現象發生。到冷藏第7天時，產品的感官品質已經表明其不適合食用。

2.5 氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中菌落總數的變化

由圖5可知：氣調包裝醬鹵鴨食管的初始（冷藏1 d）菌落總數為2.6 （lg（CFU/g）），在冷藏條件下，隨貯藏時間的延長呈快速增長趨勢;貯藏末期，產品的菌落總數為5.25 （lg（CFU/g））左右，已經大大超過GB 2726—2016《食品安全國家標準 熟肉制品》[27]中醬鹵肉制品菌落總數不得超過80 000 CFU/g的標準。

2.6 氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏過程中優勢腐敗菌的鑒定結果

經過一系列的分離、純化、篩選，共分離出69 株菌。由表2可知，經過菌落形態、菌株形態以及相關指標分析，將69 株菌共分為4 類菌群，其中菌株1占41%、菌株2占25%、菌株3占22%、菌株4占12%。

由圖6可知：菌株1與香坊腸桿菌（Enterobacter xiangfangensis）的同源性最高，相似度為99.70%;菌株2與特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）的同源性最高，相似度為99.85%;菌株3與副黃假單胞菌（Pseudomonas parafulva）的同源性最高，相似度為100.00%;菌株4與肉芽腫克雷伯氏菌（Klebsiella granulomatis）的同源性最高，相似度為99.68%。腸桿菌屬、芽孢桿菌屬及假單胞菌屬的微生物是食品中比較常見的腐敗微生物，在冷藏條件下仍然比較活躍，繁殖能力較強[28]。克雷伯氏菌屬的微生物是禽類中較為常見的微生物[29]。鴨食管在生產過程中要進行燙漂、鹵煮等過程，經過冷藏，克雷伯氏菌仍然會有殘留。葉可萍等[30]在研究氣調包裝醬鹵鴨翅中得到的優勢腐敗菌主要有嗜冷桿菌，這是由于檢測部位、原材料及生產工藝的不同，導致檢測結果有所差異。香坊腸桿菌、特基拉芽孢桿菌、副黃假單胞菌以及肉芽腫克雷伯氏菌在繁殖過程中均會有不同程度的產酸、產氣生物反應，結合醬鹵鴨食管冷藏后期會出現發酸、發黏、漲盒的情況，表明分離鑒定出的這幾種微生物是導致氣調包裝醬鹵鴨食管冷藏條件下發生腐敗變質的優勢腐敗菌。

3 結 論

在冷藏條件下，氣調包裝醬鹵鴨食管中較高的水分含量和豐富的營養物質導致其在貯藏過程中極易發生腐敗變質。氣調包裝采用的是密封性較好的材料，填充氣體為75%氮氣+25%二氧化碳，對食品中的好氧菌有較好的抑制作用。從pH值、感官特性等方面判斷，在貯藏過程中氣調包裝醬鹵鴨食管的品質變化是緩慢的，且在冷藏第8天時已完全不能食用。經分離鑒定得到，特基拉芽孢桿菌、香坊腸桿菌、肉芽腫克雷伯氏菌和副黃假單胞菌是氣調包裝醬鹵鴨食管中的主要腐敗菌。本研究結果對今后研究氣調包裝醬鹵鴨食管防腐工藝中抑菌劑及滅菌工藝的選擇均有參考意義。

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