木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對牛肉的嫩化效果研究

謝正林 莊煒杰 許俊齊 袁屹 李迪

摘 ? ?要：蛋白酶具有水解肌纖維膜和肌原纖維蛋白質作用，故其作為肉類嫩化劑應用廣泛，但不同的蛋白酶具有較強的專一性。本文采用化學提取法分別從木瓜及菠蘿中提取出木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶，分析其酶活性，并通過對照R1、木瓜蛋白酶處理R2和菠蘿蛋白酶處理R3的牛肉樣品感官、鏡檢及剪切力等指標的對比研究了兩種酶對牛肉的嫩化效果。結果表明：本試驗提取的菠蘿蛋白酶活力（8 752.7±3.3 U·g-1）高于木瓜白酶（6 348.0±2.6 U·g-1），二者均具有較好的嫩化效果，牛肉綜合感官效果和牛肉纖維斷裂程度的鏡檢結果均表現為菠蘿蛋白酶處理R3>木瓜蛋白酶處理R2>對照R1，剪切力則為對照R1>木瓜蛋白酶處理R2>菠蘿蛋白酶處理R3。綜合說明，本試驗提取的菠蘿蛋白酶對牛肉的嫩化效果優于木瓜蛋白酶，這與所提取的酶活力結果一致。

關鍵詞：木瓜蛋白酶;菠蘿蛋白酶;嫩化;牛肉

中圖分類號：TQ925+2;TS251.5+2 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.014

Abstract： Proteinase has the functions of hydrolyze sarcolemma and myofibrillar protein， so it was widely used as meat tenderizer， but different proteases have strong specificity. The experiment was conducted to study the tenderizing effects of papain and bromelain on beef by the comparison of sensory， microscopic and shear forces among the beef treatments of control （R1）， papain （R2） and bromelain （R3）， the papain and bromelain were extracted from papaya and pineapple， respectively. The results showed that in this experiment， the activity of bromelain （8 752.7±3.3 U·g-1） was higher than that of papain （6 348.0±2.6 U·g-1）. In the three treatments， the beef sensory scores and the microscopic results of the beef fiber breakage degree showed that R3>R2>R1， while the shear forces were R1>R2>R3. Comprehensively， both the papain and bromelain extracting in the experiment had good tenderizing effects， and the later one was better than the former one， which was consistent with the results of enzyme activity extracted.

Key words： papain; bromelain; tenderization; beef

木瓜蛋白酶（Papain）屬于植物來源蛋白酶范疇，提取自番木瓜的根、莖、葉、果實，是一種活性中心含半胱氨酸的半胱氨酰基蛋白酶[1]。菠蘿蛋白酶（Bromelain）提取自菠蘿果莖、葉、皮，是經精制、提純、濃縮、酶固定化、冷凍干燥而得到的一種純天然植物蛋白酶[2]，由6種以上不同分子結構和分子量的水解蛋白酶構成的酶系[3]。經食品藥品監督管理局批準，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶均可用于食品配方和食品加工中。在肉食品加工業中，二者常用來嫩化原料肉[4]，是嫩肉粉的主要成分，可對肉中的彈性蛋白和膠原蛋白進行部分水解，使肉類制品的口感達到嫩而不爛、鮮香味美的效果[5]。

目前，有關肉的嫩化主要有化學試劑嫩化法、腌制法、注射法、合成嫩化劑嫩化法等[6]，這些方法雖能很好地對肉制品進行嫩化但其毒副作用較大，對營養成分的破壞明顯，而利用天然水解蛋白酶對原料肉嫩化則具有安全健康的優勢[7]。筆者分別從口感、鏡檢、剪切力及酶活性幾方面探究了木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對牛肉的嫩化效果，為二者在食品工業的生產和應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮木瓜、菠蘿、牛肉，硫酸銨，透析袋（截留相對分子質量6 000～12 000），0.1 mol·L-1 pH值7.8的PBS（磷酸緩沖液），1%酪蛋白，激活劑[含25 mmol·L-1半胱氨酸-鹽酸鹽、1.5 mmol·L-1 EDTA-Na2 （乙二胺四乙酸二鈉）]，10%TCA（三氯乙酸）。所用試劑均為化學純。

冷凍離心機（上海安享科學儀器廠），真空干燥機（上海精宏實驗設備有限公司），真空泵（鞏義市子華儀器有限公司），分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公式醫療設備），配有WBS（Warner-Bratzler Shear）刀具的相關剪切力測定儀，熱電偶測溫儀（探頭直徑小于2 mm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶的提取 ? ?主要流程：粗酶提取→鹽析純化→透析純化→冷凍干燥備用。

主要步驟：稱取新鮮木瓜、菠蘿各100 g，將其洗凈，瀝干，粉碎，加入100 ?mL預冷0.1 mol·L-1 pH值7.8 的PBS溶液，攪拌后用6層紗布過濾，濾液于4 ?℃，5 ?000 r·min-1離心5 min，棄沉淀，即得到酶粗提液。向酶粗提液中添加硫酸銨，使溶液飽和，4 ℃靜置20 min，酶蛋白沉淀析出，離心，收集沉淀，加入0.1mol·L-1 pH值7.8 的PBS溶液約50 mL至完全溶解。將溶解液裝入3.5 cm×15 cm透析袋用蒸餾水透析，將透析液用濾紙過濾，收集蛋白酶沉淀備用。

1.2.2 酶活力測定 ? ?兩種酶的活力測定均采用酪蛋白法測定：取所得酶制劑0.15 g，加入0.01 mol·L-1 pH值7.0 的PBS溶液定容至100 mL，過濾，濾液即為工作酶液。取4支試管，1支為空白對照，3支為平行樣品，具體操作步驟按照表1完成。

反應結束后，所得濾液過濾，清液于275 nm波長下測定光吸收值。最后酶活結果取3次重復試驗的平均值。

1.2.3 兩種酶對肉的嫩化及指標測定 ? ?（1）感官測定。取3塊500 g牛后腿肉，清洗去血污，修整，去除可見脂肪、結締組織[12]。處理后的牛肉，其中一塊不經任何處理視為R1（對照），分別取20 g粉末狀木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，均勻地撒在另外2塊肉塊上，分別記為R2和R3。腌制60 min后放入水浴鍋中85 ℃煮10 min后取出，各處理肉塊分別均勻切成100小塊。隨機選取20位評價人根據表2評判標準判定R2和R3的嫩化效果，并與對照R1進行對比，取均值為最終調查判定結果。

（2）鏡檢。將相同方法嫩化處理的R1、R2、R3去除表面后切薄片取樣置于顯微鏡下觀察，對其纖維斷裂情況進行對比。

（3）剪切力測定。剪切力的測定參考NY/T1180-2006[8]，取肉樣（6 cm×3 cm×3 cm），剔除肉表面的筋、腱、膜及脂肪。放入預加熱到80 ℃的恒溫水浴鍋中加熱，當肉樣的中央溫度達75 ℃的時，將肉樣取出立即冷卻至中心溫度為2～6 ℃。用半徑為0.6 cm的圓形取樣器在距離肉樣邊緣6 mm內鉆切肉樣（沿與肌纖維平行鉆切），孔樣深度大于2.5 cm，每個孔樣間距不小于6 mm，選取標準平行肉樣3個。把孔樣放置在測定儀的刀槽上，使刀口與肌纖維垂直。測得數據中，刀片切割過程中的最大剪切力值（峰值）就是孔樣剪切力值。記錄所有的測定數據，取各個孔樣剪切力測定值的平均值扣除空載運行最大剪切力，計算肉樣的嫩度值（X）。計算公式：

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶活力

經檢測，菠蘿蛋白酶的平均酶活力（8 ?752.7±3.3 ?U·g-1）顯著高于木瓜白酶（6 348.0±2.6 U·g-1）（P<0.05）。

2.2 感官對比

對照R1肉呈紅色，有光澤，脂肪均勻呈淡白黃色，表面干燥微粘手，新切面濕潤，指壓后凹陷恢復較慢，肉味正常，煮沸后的肉湯透明澄清;R2肉呈紅色，有光澤，表面干燥微粘手，指壓后凹陷恢復略快，肉味正常，煮沸后的肉湯透明澄清;R3肉呈紅色，有光澤，脂肪均勻呈淡白黃色，表面干燥粘手，新切面濕潤，指壓后凹陷恢復較快，肉味較佳，煮沸后的肉湯透明澄清，脂肪團聚于表面具有香味。由表3可知，R1、R2和R3的牛肉色澤保持一致，而牛肉粘度、彈性及煮沸后的肉湯評分均表現為R3>R2>R1，氣味表現為R3略高于R1和R2。

2.3 鏡檢對比

由圖1可以看出，與對照R1相比較，經過兩種酶處理的牛肉樣品R2和R3，肌纖維開始斷裂，原有的韌性組織逐漸失去，其中菠蘿蛋白酶處理R3牛肉肌細胞排列凌亂無序，較木瓜蛋白酶處理R2肌纖維中斷裂片段明顯增加。

2.4 剪切力對比

由圖2可以看出，經菠蘿蛋白酶處理R3肉樣的平均剪切力最小為27.3 N，其次是經木瓜蛋白酶處理R2肉樣，其平均剪切力為30.4 N，而對照R1肉樣平均剪切力最大，為35.1N，3組處理之間差異顯著（P<0.05）。分析原因在于，酶將肉中的結締組織及肌纖維中結構較復雜的膠原蛋白、彈性蛋白進行適當降解，使得牛肉結構中的某些連接鍵發生斷裂，從而大大降低了牛肉的平均剪切力;而兩種酶對牛肉中蛋白質的降解及連接鍵斷裂程度不同，故R2和R3的平均剪切力也不同，其中后者低于前者，說明菠蘿蛋白酶對蛋白質的降解程度更高，即菠蘿蛋白酶對牛肉的嫩化效果優于木瓜蛋白酶嫩化效果。

3 結論與討論

肉品嫩度是消費者評判肉質優劣最常用的指標。肉的嫩化方法有物理、化學和生物法，生物法中由植物中提取的酶類主要有木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶等，此類酶對結締組織有較強的分解作用，嫩化效果十分顯著，其中木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶是目前商品酶類的主要種類[9]。

本試驗中，不同處理牛肉綜合感官效果表現為菠蘿蛋白酶處理R3>木瓜蛋白酶處理R2>對照R1，剪切力表現為R1>木瓜蛋白酶處理R2>菠蘿蛋白酶處理R3（剪切力越小其嫩化效果越好），鏡檢結果表現為菠蘿蛋白酶處理R3牛肉纖維斷裂程度高于木瓜蛋白酶處理R2，二者均高于對照R1。綜合說明木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶均具有較好的嫩化效果，且后者效果優于前者，這應該主要受二者酶活性亦表現為后者顯著高于前者所致。此外，兩種酶的作用機制不同，木瓜蛋白酶主要是消化纖維，嫩化后的牛肉有塌陷，而菠蘿蛋白酶主要作用表現為纖維斷裂，此結論與關國雄等[10]研究結果一致。

參考文獻：

[1]常慧敏，楊敬東，田少君.超聲輔助木瓜蛋白酶改性對米糠蛋白溶解性和乳化性的影響[J].中國油脂，2019，44（4）：35-40.

[2]唐梅，勞斌基，林遠敢，等.響應面法優化超濾提取菠蘿蛋白酶工藝條件[J].食品研究與開發，2016，37（7）：56-61.

[3]田欣，張藝凡.菠蘿蛋白酶的提取及應用[J].食品安全導刊，2017（33）：121.

[4]韋朝英.木瓜蛋白酶提取及在食品工業中的應用[J].農業與技術，2018，38（15）：71-72.

[5]李培紅，王懷欣，郇延軍.木瓜蛋白酶對豬肉脯嫩化效果的研究[J].肉類研究，2011，25（1）：40-45.

[6]方煥，生吉萍，吳顯榮.工業生產中木瓜蛋白酶的活性檢測方法比較[J].食品與機械，2000（6）：27-29.

[7]王攀，范娜.木瓜蛋白酶酶解核桃餅粕制備抗氧化多肽的研究[J].江蘇農業科學，2019，47（11）：238-241.

[8]中華人民共和國農業部. NY/T 1180-2006 肉嫩度的測定 剪切力測定法[S].北京：中國農業出版社，2006.

[9]熊華.木瓜蛋白酶應用研究進展[J].保鮮與加工，2006（1）：7-8.

[10]關國雄，顏子穎，林哲甫.彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶對不同蛋白質水解能力的比較[J].食品科學，1992（3）：4-6.