硫化氫提高水稻磷吸收轉運的生理和分子機制

朱春權 曹小闖 朱練峰 白志剛 黃潔 梁清鐸 金千瑜 張均華

硫化氫提高水稻磷吸收轉運的生理和分子機制

朱春權 曹小闖 朱練峰 白志剛 黃潔 梁清鐸 金千瑜 張均華*

(中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，杭州 310006；*通訊聯系人，E-mail: zhangjunhua@caas.cn)

低磷脅迫是限制水稻產量的主要因素之一。水稻淹水條件下產生H2S，然而，H2S作為信號分子是否參與調節水稻響應缺磷脅迫還未可知。在正常磷和低磷條件下測定水稻H2S含量，揭示H2S在水稻響應缺磷脅迫中的作用。用2 μmol/L H2S前體物質NaHS預處理水稻1 d，然后在加磷和低磷條件下培養6 d，測定水稻體內總磷含量、酸性磷酸酶活性、抗氧化酶活性、木質部汁液磷含量、磷轉運子基因表達以及根系構型變化，從而探究H2S參與調節水稻響應缺磷脅迫的生理和分子機制。低磷脅迫下，水稻根系和地上部H2S含量顯著增加。NaHS預處理水稻顯著增加低磷條件下水稻體內有效磷和總磷含量，提高根系酸性磷酸酶活性，提高抗氧化酶活性、木質部汁液磷含量和磷轉運子基因表達水平，同時還改變水稻根系構型，增加總根長、總根表面積、總根體積和總根尖數，從而促進低磷條件下水稻對外界磷的吸收和轉運，最終緩解缺磷脅迫。

水稻；低磷脅迫；硫化氫；磷轉運子；根系構型

磷是植物所需的僅次于氮的第二大營養元素，植物中的全磷含量約占其干質量的0.05%~ 0.50%[1]。植物體內的磷廣泛參與光合作用、信號轉導、酶促反應、呼吸作用和碳氮代謝等過程，同時，磷也是植物體內眾多細胞組織的組成成分，比如核酸、酶、細胞膜等[2]。然而，由于土壤中的磷易被土壤顆粒和陽離子固定或者被微生物轉化為有機磷[3]，因此土壤中能被植物直接吸收利用的磷含量很低，不能滿足植物正常生長。

生產上常通過增施磷肥保證作物正常磷肥供應。然而，施入土壤中的磷利用率很低，當季利用率約為10%~20%[4]。剩余的磷肥通過雨水等進入湖泊，造成富營養化污染。植物擁有多種調控機制緩解缺磷脅迫，比如改變根系構型，促使根系向含磷量較高的表層土延伸或者通過增加根系側根或根毛擴大磷的吸收利用范圍[5-7]。同時，根系也會分泌質子、有機酸和次級代謝物等，促使土壤中的磷溶解出來，供植物吸收利用[2, 8, 9]。除了擴大對外界磷的吸收，植物還會通過提高體內磷的再利用緩解缺磷脅迫。比如改變糖酵解途徑，繞過需要ATP的步驟[10]；提高酸性磷酸酶酶活，促進體內有機磷的再利用[11]；提高細胞壁果膠含量，增加細胞壁結合態磷的再利用[12]等。

眾多信號分子參與調控植物緩解缺磷脅迫。比如乙烯參與調控矮牽牛花衰老組織中磷的釋放和增加高親和磷轉運子基因的表達，將衰老組織中的磷向新生組織轉運[13]；一氧化氮(NO)通過調節白羽扇豆中排根的形成并且促進檸檬酸的釋放使其增加對外界磷的吸收利用[14]。硫化氫(H2S)是除NO和一氧化碳(CO)外的第三種氣體信號物質，其廣泛參與植物的正常生理活動和對外界逆境的抵抗[15]。如促進植物種子的萌發[16]和植物器官的形成[17]，調節氣孔的閉合[18]，緩解離子毒害[19]和高溫脅迫[20]等。H2S參與調控植物響應養分脅迫的研究較少，但也有研究發現，H2S參與水稻在完全缺磷條件下對水稻細胞壁結合態磷的再利用過程，從而緩解缺磷脅迫[21]。

本研究以常規水稻品種日本晴作為研究材料，通過外源添加H2S供體硫氫化鈉(NaHS)，測定水稻在正常磷和低磷脅迫下體內磷含量變化和生理分子變化，以期進一步探究H2S調控水稻響應低磷脅迫的生理和分子機制，從而為實際生產中提高水稻磷利用率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 水稻培養條件與處理

本研究以粳稻品種日本晴作為實驗材料，在30℃條件下將水稻種子催芽后，鋪在2 mm格子的塑料板上，將其培養在0.5 mmol/L CaCl2溶液中。當水稻芽長至1 cm左右時，將CaCl2溶液換成改良的木村營養液[12]。待水稻長至兩葉一心，將其移到1.5 L水培罐中，每罐10株水稻。

H2S測定實驗：將兩葉一心的水稻在低磷(18 mmol/L)的營養液中培養，分別在0(即正常磷含量)，1，3，5，7 d收集水稻根系和地上部，用于測定H2S含量。

H2S促進水稻磷吸收實驗：兩葉一心的水稻在正常磷(180 mmol/L；P)和低磷(18 mmol/L；LP)營養液中培養，分別添加或者不加2 μmol/L的H2S供體NaHS，1 d后將營養液倒掉，分別繼續在正常磷和低磷營養液中培養6 d，每隔3 d換一次營養液，營養液pH為5.6。四個處理分別標記為P(正常磷含量)、P+NaHS、LP(低磷)和LP+NaHS。

1.2 硫化氫含量的測定

收取水稻根和地上部，洗凈稱重。用液氮研磨后加入5 mL 50 mmol/L pH6.8的磷酸(PBS)緩沖液，內含0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)和0.2 mmol/L抗壞血酸。H2S含量的根據加入20 mmol/L二甲基對苯二胺二氫氯胺（溶解在7.2 mol/L HCl中）后生成的亞基藍深淺進行測定[22]。

1.3 總磷的提取和測定

收集水稻根和地上部后裝入信封在烘箱中105℃下殺青30 min，然后在75℃下將植物樣本烘干至恒重。稱取根和地上部干質量，用濃H2SO4和過氧化氫(H2O2)消煮，超純水定容后用鉬銻抗法測定水稻總磷含量[23]。

1.4 酸性磷酸酶的測定

收集水稻根系鮮樣稱重，冰上研磨后用0.2 mmol/L醋酸鈉緩沖液提取根系酸性磷酸酶。將酶粗提液與反應液(0.2 mmol/L pH 5.8 的醋酸鈉緩沖液，內含0.5 g/L對硝基苯磷酸二鈉)混合，在25℃黑暗條件下培養1 h，加入6 mol/L的NaOH終止反應，在400 nm波長下比色。通過單位時間內單位重量的根催化對硝基苯磷酸二鈉生成對硝基苯酚的量來表示酶活[24]。

1.5 抗氧化酶的活性測定

收集水稻根和地上部，鮮樣稱重。冰上研磨，加入2 mL 提取液(50 mmol/L pH 7.8的PBS緩沖液，內含1 mmol/L EDTA-Na2和1 mmol/L 醋酸)，在15 000、4℃溫度下離心15 min，取上清，作為酶粗提液。

SOD酶活測定：取50 μL酶粗提液與1.5 mL 50 mmol/L的pH 7.8 PBS緩沖液，0.3 mL 20 μmol/L的核黃素，0.3 mL 150 μmol/L L-蛋氨酸，0.3 mL 750 μmol/L氮藍四唑，0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2和0.25 mL水混合，在室溫光照條件下反應20 min。做一個陰性對照，560 nm下比色[25]。

表1 本研究中使用的引物序列

CAT酶活測定：取0.1 mL酶粗提液與1.9 mL 50 mmol/L pH7.0的PBS緩沖液和 1 mL 0.1% H2O2反應，在反應剛開始和1 min后分別記錄240 nm下的吸光值[26]。

APX酶活測定：取0.1 mL酶粗提液與1.5 mL 50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)，0.5 mL 0.3 mmol/L的抗壞血酸, 0.5 mL 0.1 mmol/L乙二胺四乙酸鈉0.4 mL 0.06 mmol/L H2O2混合，在反應10和30 s分別記錄290 nm下的吸光值[27]。

POD酶活測定：取50 μL酶粗提液與1 mL 50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 5.5)，0.95 mL 0.2%愈創木酚, 1 mL 0.3% H2O2混合，分別在反應30和90 s記錄470 nm下的吸光值[28]。

1.6 木質部汁液磷的提取和測定

將水稻距離根上部2 cm處切斷，用移液器吸取流出的傷流液，持續2 h[29]。將吸取的傷流液合并記錄體積，適當稀釋后用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測定磷含量。

1.7 水稻根系構型參數的測定

將水稻根系剪下后鋪在含水的塑料盤中，用EPSON 10000XL掃描儀獲得根系的掃描圖片。然后運用WinRHIZO根系分析系統(加拿大Regent 儀器公司)計算根系的總根長、總表面積、平均直徑、總體積和根尖數等指標[30]。

1.8 水稻總RNA的提取和基因表達測定

水稻的根系吸干水分后剪下，立即在液氮中研磨。利用TRizol法提取里面的總RNA。在NanoDrop上測定RNA的含量并用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。運用PrimeScript反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)將RNA反轉成cDNA并用Sybgreen(TaKaRa，日本)進行實時熒光定量PCR。表1為所選基因的引物和內參基因引物[31-36]。

1.9 統計學分析

實驗均設4個生物學重復，每個處理重復3次。數據采用SPSS 21.0.0 軟件進行統計分析(單因素方差分析)，均數采用圖基(Tukey)檢驗統計學差異。圖中不同字母表示不同處理間均值在< 0.05水平上有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 H2S提高水稻體內總磷含量

相較于正常磷條件，水稻根部和地上部的H2S含量在低磷脅迫1 d后急劇增加，隨著低磷脅迫時間的增加，水稻體內H2S含量逐漸下降，并最終恢復到起始含量(圖1)。

在正常磷和低磷脅迫條件下，用H2S的供體NaHS預處理水稻后，顯著增加了水稻根部和地上部的總磷含量(圖2)。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在0.05水平上顯著。缺磷處理的磷濃度為18 mmol/L。

Fig. 1. Content of H2S in rice root and shoot under different phosphorus deficient durations.

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在P < 0.05水平上顯著。P－營養液中磷濃度為180 mmol/L, LP－18 mmol/L。

Fig. 2. Available P and total P contents in rice roots and shoots.

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在P < 0.05水平上顯著。P－180 mmol/L; LP－18 mmol/L。

Fig. 3. Activites of acid phosphatase in rice roots and shoots.

2.2 H2S提高酸性磷酸酶活性

在低磷條件下，水稻根部和地上部的酸性磷酸酶活性顯著高于正常磷條件，用NaHS預處理后，水稻根系和地上部的酸性磷酸酶活性進一步增強(圖3)。

2.3 H2S提高磷轉運子基因的表達

無論是正常磷還是低磷脅迫條件下，NaHS預處理均顯著增加水稻木質部汁液中的磷含量(圖4)。

水稻體內磷轉運子PHT1家族共有13個成員，分別為~。其中和主要在菌根共生過程中誘導[37, 38]。因此，本研究沒有測定以上兩個磷轉運子基因的表達。//主要參與水稻體內磷的轉運。在本研究中，和基因的表達雖然在低磷脅迫下顯著增加，但是與NaHS預處理組沒有顯著差異，只有基因的表達量在添加NaHS后進一步增加(圖5)。

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在P < 0.05水平上顯著。P－180 mmol/L, LP－18 mmol/L。

Fig. 4. Xylem P concentration in rice.

數據用均值±標準差(n = 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在P < 0.05水平上顯著。P－180 mmol/L, LP－18 mmol/L。

Fig. 5. Relative expression level of P transporter genes.

同時，通過測定磷轉運子PHT1家族其余已經證明功能的基因成員的表達，發現、、和的基因表達均在低磷脅迫下顯著高于正常磷條件，并且用NaHS預處理后表達量進一步增加(圖5)。

2.4 H2S提高抗氧化酶活性

共測定了水稻根部和地上部4種抗氧化酶系統的酶活性，發現在低磷脅迫下，水稻根系和地上部的SOD、CAT、APX和POD的酶活均顯著增強，并且在用NaHS預處理后進一步增加了以上4個酶的活性(表2)。

2.5 H2S改變水稻根系構型

在缺磷條件下，水稻根系總根長、總表面積、總體積和總根尖數顯著增加，并且在用NaHS預處理后，低磷條件下以上4個根系生長指標均進一步增加(圖6和表3)。

3 討論

H2S是一種新型信號分子，主要參與調節植物響應逆境脅迫，比如高溫脅迫[20]、鋁脅迫[39]和缺磷脅迫[21]等。在本研究中，水稻根系和地上部的H2S含量均在缺磷1 d后顯著增加，然后逐漸減少，并在缺磷7 d時回到正常水平(圖1)，同時，在外源添加H2S供體NaHS后，在低磷脅迫下水稻根部和地上部的總磷含量顯著增加(圖2)，進一步證明了H2S作為信號分子，參與調節水稻響應低磷脅迫。

表2 水稻根系和地上抗氧化酶活性

數據用均數±標準差(= 4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在< 0.05水平上顯著。其中正常磷（P）處理的磷濃度為180 mmol/L，低磷（LP）處理的磷濃度為18 mmol/L。

Data are means ± SD (= 4). Different letters mean significantly difference at< 0.05. P, 180 mmol/L, LP, 18 mmol/L.

表3 水稻根系發育相關指標

數據用均數±標準差(=4)表示。不同的小寫字母代表處理間差異在< 0.05水平上顯著。其中正常磷（P）的磷濃度為180 mmol/L，低磷（LP）處理的磷濃度為18 mmol/L。

Data are means±SD (=4). Different letters mean significantly difference at< 0.05. P, 180 mmol/L, LP, 18 mmol/L.

酸性磷酸酶作為一種誘導酶，其活性顯著受植物供磷水平的影響[40]。在玉米和黃瓜的研究中均發現，在缺磷脅迫下，植物體內的酸性磷酸酶活性顯著增加[41, 42]。雖然酸性磷酸酶活性與植物耐低磷能力并不總是存在顯著正相關[43]，但是一般認為，植物在缺磷脅迫下提高酸性磷酸酶的活性，可以將體內的有機磷轉化為無機磷，供植物再次利用；同時，酸性磷酸酶還能促進植物中的磷從衰老組織向幼嫩組織的轉運，從而優先保證植物幼嫩組織的生長[44]。在本研究中發現，水稻根系和地上部的酸性磷酸酶活性在低磷條件下顯著增加，并且用NaHS預處理后進一步提高了酸性磷酸酶的活性(圖3)，結合NaHS提高了低磷條件下水稻根系和地上部的總磷含量(圖2)，暗示H2S在一定程度上可以通過調節酸性磷酸酶的活性緩解水稻低磷脅迫。

植物體內分為PHT1、PHT2、PHT3和PHT4共4個磷轉運子家族，分別負責轉運細胞膜、葉綠體膜、線粒體膜和高爾基體膜上的磷。水稻的PHT1磷轉運子家族共有13個基因成員(分別為~)，在水稻體內磷的吸收和轉運中分別起特定功能。目前研究發現，水稻體內的、和負責水稻體內磷的轉運。主要在水稻根中柱中表達并且負責將磷從根部往地上部的運輸；主要在水稻根表皮、皮質和中柱表達，具有磷吸收和體內轉運雙重功能[31]；在水稻根系和葉片中表達，參與水稻體內磷庫和源的再分配和磷的吸收[32]。在本研究中，在低磷條件下，用NaHS預處理后水稻木質部汁液中的磷含量顯著高于單純的低磷處理(圖4)，說明H2S提高了水稻根系中的磷往地上部的轉運。磷轉運子基因表達結果顯示，在低磷條件下，、和三個基因的表達均比正常磷條件下顯著增加，然而用NaHS預處理后，只有基因的表達進一步增加(圖5)，說明H2S通過調節磷轉運子基因的表達提高體內磷從根部往地上部的轉運。

Fig. 6. Phenotype of rice roots.

水稻磷轉運子家族PHT1的其余成員在水稻磷吸收中也發揮重要作用。比如過表達基因顯著增加水稻體內的磷含量和分蘗數[45]。磷轉運子主要在水稻根系質膜上表達，負責水稻根系對外界磷的吸收并且與水稻胚的發育密切相關[47]。缺磷脅迫顯著增加和基因的表達，并且在水稻中過表達這2個基因后，顯著增加水稻在缺磷條件下和正常磷條件下對外界磷的吸收[34]。在本研究中，低磷脅迫顯著增加了、、和的表達，并且在用NaHS預處理后進一步提高了它們的表達(圖5)，說明在低磷脅迫下，H2S主要通過調節以上4個基因的表達促進水稻從外界吸收磷。低磷脅迫同時促進了、和的表達，但是NaHS預處理并沒有進一步增加它們的表達(圖5)，說明以上3個基因受缺磷脅迫誘導，但是不受H2S調節。測定的基因中，只有基因的表達在4個處理下均未有顯著變化(圖5)，其主要原因是基因是一個組成型基因，它的表達不受外在磷含量的影響[47]。

過氧化物在植物體內持續產生，并且在遭受脅迫時大量產生[48]。在脅迫條件下，植物體內產生和積累的大量活性氧物質，比如H2O2，·OH?，O2·?對植物的質膜造成過氧化損傷，從而影響植物正常生長。植物體內存在抗氧化酶系統，主要負責將植物體內的活性氧物質進行還原，從而緩解過氧化損傷。超氧化物歧化酶主要負責催化植物體內的超氧化陰離子自由基，將其轉化成氧和H2O2[49]。過氧化氫酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶均負責還原植物體內的過氧化物，從而緩解過氧化損傷[48]。在本研究中，缺磷條件下，用NaHS預處理后，水稻根部和地上部的抗氧化酶的活性均顯著增加(表2)，從而進一步清除水稻體內的過氧化物，緩解由于缺磷而導致的過氧化損傷。

改變根系構型是植物緩解缺磷脅迫的有效手段之一。在缺磷脅迫下，植物的根系在土壤中的空間布局發生變化，更多的根分布在含磷量較高的表層土壤[5]，同時由于鐵元素的大量積累，缺磷條件下植物的主根伸長受到抑制[50]，然而，植物根系的側根和根毛卻能大量生長和伸長[6, 51]，增加植物根冠比，從而促進植物對環境中磷的吸收。比如缺磷時，甜菜的側根顯著增多增長[6]，黑麥草根毛含量顯著增加[7]，從而提高磷吸收。在本研究中，低磷條件下水稻根系的總根長、總表面積、總體積和總根尖數均顯著增加(圖6和表3)，說明水稻也通過改變根系構型來響應缺磷脅迫。用NaHS預處理后，以上4個指標均進一步增加(圖6和表3)，說明H2S還通過調節水稻根系構型的變化，增加其對外界磷的吸收，從而緩解缺磷脅迫。

4 結論

在低磷條件下，H2S通過調控酸性磷酸酶活性，提高磷轉運子基因表達和改變根系構型擴大水稻對外界磷的吸收以及體內磷的轉運平衡。同時H2S還通過調節抗氧化酶的活性減少低磷脅迫導致的過氧化損傷，從而最終緩解缺磷脅迫。

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Physiological and Molecular Mechanisms of Hydrogen Sulfide Enhancing Phosphorus Absorption and Transportation in Rice

ZHU Chunquan, CAO Xiaochuang, ZHU Lianfeng, BAI Zhigang, HUANG Jie, LIANG Qingduo, JIN Qianyu, ZHANG Junhua*

(,,,;Corresponding author,:)

Low phosphorus (P) stress is one of the main factors limiting rice yield. Hydrogen sulfide (H2S) is produced in rice under flooding conditions. However, whether H2S is involved in the regulation of rice response to phosphorus deficiency stress as a signal molecule is still unclear.The content of H2S in rice was determined under normal and low P conditions to illuminate the role that H2S plays in regulating rice response to P deficiency stress.Rice was pretreated with 2 μmol/L H2S precursor NaHS for 1 day, then cultured for another 6 days under P sufficient and deficient conditions. The total P contents, acid phosphatase activity, antioxidant enzyme activity, xylem P concentration, P transporter genes’ expression and rice root architecture were determinedto explore the physiological and molecular mechanism of H2S in regulating rice response to phosphorus deficiency stress.Low P stress significantly increased the content of H2S in rice roots and shoots. NaHS pretreatment significantly increased total P contents, root acid phosphatase activity, root antioxidant enzymes activity, xylem P concentration and stimulated the expression of P transporter genes. Meanwhile, NaHS pretreatment modified rice root architecture, including increased total root length, total root surface area, total root volume and total root tip numbers. Therefore, our present study demonstrated that H2S improved P absorption and translocation in rice under P deficiency conditions and finally alleviate P deficiency stress in rice.

rice; P deficiency stress; H2S; P transporter; root architecture

S143.2; S511.01

A

1001-7216(2019)06-0532-09

10.16819/j.1001-7216.2019.9055

2019-05-13；

2019-07-31。

國家重點研發計劃資助項目(2016YFD0101801)；國家自然科學基金面上項目(31872857)；浙江省自然科學基金資助項目(LY18C020005)；國家公益研究所基礎研究基金資助項目(2017RG004-2)。