口腔脫落細胞RASSF1A甲基化在口腔鱗癌病情及預后評估中的價值

李云峰（通訊作者） 楊丕波 王瑾

（1 湖北省第三人民醫(yī)院＜湖北省中山醫(yī)院〉口腔科 湖北 武漢 430033）

（2 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院口腔科 湖北 武漢 430030）

口腔鱗癌的發(fā)病機制被越來越多的研究證實與表觀遺傳學中的基因甲基化異常有關，可用于口腔鱗癌的病情及預后評估，可能較傳統(tǒng)的蛋白質水平的腫瘤標志物具有更高的靈敏度及特異性[1,2]。Ras相關區(qū)域家族1A（RASSF1A）為調控細胞周期的抑癌基因，其甲基化異常被多個研究證實與多種惡性腫瘤的發(fā)病機制密切相關[3,4]，但在口腔鱗癌方面尚無相關研究。本研究檢測口腔鱗癌患者口腔脫落細胞RASSF1A基因甲基化，研究其在口腔鱗癌病情及預后評估中的價值。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

研究對象為2015年1月-2019年1月診治的口腔鱗狀細胞癌患者（鱗癌組），納入標準：（1）口腔檢查、顱腦磁共振和口腔活檢或術后病理組織學確診；（2）首次診治，既往無口腔鱗癌病史及未行手術、放療及化療治療史；（3）無合并其他腫瘤性疾病；（4）知情并同意本研究。鱗癌組患者共納入80例研究對象。另選擇同期門診行口腔體檢的正常健康人為對照（對照組）。鱗癌組和對照組研究對象在性別、年齡、體質量指數及吸煙史方面均具有可比性，差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 鱗癌組和對照組研究對象基本資料比較

1.2 RASSF1A基因甲基化檢測

鱗癌組和對照組研究對象均采用細胞刷刷取口腔脫落細胞，鱗癌組取材部位為病變處。提取口腔脫落細胞基因組總DNA后采用基因甲基化特異性PCR法檢測RASSF1A基因甲基化，采用Methprimer 2.0設計引物，引物序列見表2，反應體系為50μL，反應條件為：95℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸10min，共30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸6min。擴增產物經凝膠電泳后顯色判斷結果（根據M和U擴增條帶判斷，結果為甲基化和未甲基化），見表2。

表2 甲基化特異性PCR法檢測RASSF1A甲基化引物序列

1.3 統(tǒng)計學分析

數據采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 RASSF1A甲基化比較

鱗癌組口腔鱗癌患者中檢測出RASSF1A甲基化56例，RASSF1A甲基化率為70.0%，對照組正常健康人中檢測出RASSF1A基因甲基化2例，RASSF1A甲基化率為2.5%，鱗癌組患者RASSF1A甲基化率顯著高于對照組（P＜0.001）。

2.2 RASSF1A甲基化與臨床病理因素的關系

本組80例口腔鱗癌患者RASSF1A甲基化率在性別、年齡和病灶部位中無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），在吸煙史、分化程度、腫瘤最大徑和TNM分期中的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有吸煙史、分化程度低、腫瘤最大徑≥3cm和Ⅲ+Ⅳ患者RASSF1A甲基化率顯著無吸煙史、中＋高分化程度、腫瘤最大徑＜3cm和Ⅰ+Ⅱ患者，見表3。

表3 口腔鱗癌不同臨床病理因素RASSF1A甲基化的差異

3.討論

口腔鱗癌的發(fā)病機制與基因突變和表觀遺傳學改變有關，其中表觀遺傳學是新近發(fā)現(xiàn)的與DNA堿基序列突變無關的基因表達調控機制，而基因甲基化修飾是表觀遺傳學最常見的調控機制[5]。研究表明，基因啟動子區(qū)域CG甲基化修飾后，甲基化CG自身或結合甲基結合蛋白后可阻遏轉錄因子與結合，從而發(fā)揮轉錄前調控作用，基因異常甲基化可用于腫瘤的病情及預后評估[6]。RASSF1A為調控細胞周期的抑癌基因，其甲基化異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉歸密切相關[7,8]。本研究中，采用甲基化特異性PCR檢測口腔鱗癌患者口腔脫落細胞RASSF1A基因甲基化，發(fā)現(xiàn)其RASSF1A基因甲基化率顯著高于對照組正常健康人，表明RASSF1A基因甲基化可能與口腔鱗癌的發(fā)病機制密切相關。

越來越多的研究證實表觀遺傳學的基因甲基化可用于口腔癌的病情及預后評估，與傳統(tǒng)的腫瘤標志物相比具有更高的特異性及靈敏度[9,10]。本研究比較口腔鱗癌患者口腔脫落細胞RASSF1A甲基化在不同臨床病理因素中的差異，發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因甲基化率在性別、年齡和病灶部位中無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），在吸煙史、分化程度、腫瘤最大徑和TNM分期中的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），有吸煙史、分化程度低、腫瘤最大徑≥3cm和Ⅲ+Ⅳ患者RASSF1A基因甲基化率顯著高無吸煙史、中＋高分化程度、腫瘤最大徑＜3cm和Ⅰ+Ⅱ患者，這些證據表明口腔脫落細胞RASSF1A基因甲基化可作為口腔鱗癌病情嚴重及預后評估的基因水平標志物，與術后切除標本檢測相比，口腔脫落細胞的檢測可在術前為口腔鱗癌的病情及預后評估提供客觀證據，更具有臨床價值。

綜上所述，RASSF1A基因在口腔鱗癌中呈甲基化狀態(tài)，與吸煙史、分化程度、腫瘤最大徑和TNM分期密切相關，在口腔鱗癌病情及預后評估中具有重要臨床價值。