尪痹片對骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化過程中的成骨標志物的影響研究

劉益臻 李立章 王炎 付坤飛

（貴州中醫藥大學 貴州 貴陽 550001）

尪痹片由著名國醫大師焦樹德教授創立，是國家六類新藥痹病系列藥之一，為中華中醫藥學會風濕病分會協定處方，臨床用于治療類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis,RA）療效顯著，病理研究和臨床研究均表明該藥可減輕骨破壞程度,促進骨形成[1,2]，骨形成的重要細胞為成骨細胞，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可分化為成骨細胞[3]，因此本研究使用尪痹片含藥血清體外干預骨髓間充質干細胞，探討其對成骨分化的保護作用。

1.資料與方法

1.1 藥物與試劑

尪痹片，仙靈骨葆膠囊，甲氨蝶呤片，SD大鼠骨髓間充質干細胞株（中國科學院），成骨分化培養基，茜素紅，腫瘤壞死因子α，TNF-α，一步法快速WB（HRP）試劑盒，高靈敏度化學發光檢測試劑盒，蛋白膜印跡再生液，TRNzol總RNA提取試劑，PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR?Premix Ex Taq ? Ⅱ,ROX plus，DL2,000 DNA Marker，康為世紀SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（CW0022），堿性磷酸酶（AKP）測試盒。

1.2 實驗儀器

No：164-5050電 泳 儀，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白電泳槽，Mini Trans-Blot，蛋白轉印系統，TY-80脫色搖床。ZS-2板式酶標儀，202-2AB電熱恒溫箱，ABI7500熒光定量PCR儀，SK-D1807-E Analog 3D Shaker，RS-25S超聲波細胞粉碎機，LIDE 200掃描儀，ST60-4微孔板恒溫振蕩器，AUW-220D電子分析d平。

1.3 含藥血清的制備

清潔級SD大鼠雄性60只（中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心，許可證號：SCXK2012-0011），隨機分成6組，每組10只，分別為空白組、尪痹片高劑量組、尪痹片中劑量組、尪痹片低劑量組、仙靈骨葆膠囊組，甲氨蝶呤組，每組10只。尪痹片高劑量組(9630 mg/kg)，尪痹片中劑量組(4815 mg/kg)，尪痹片低劑量組(1070 mg/kg)，仙靈骨葆膠囊組(1320 mg/kg)，甲氨蝶呤組(11mg/kg)，空白組給予生理鹽水2 mL,高劑量是人常規劑量的18倍，中劑量是人常規劑量的9倍，低劑量組、仙靈骨葆組和甲氨蝶呤組均為人常規劑量的5倍，連續給藥10日，每日一次。取血前禁食12小時，使用摘眼球取血法，取血后靜置30 min，放入離心機中低速離心3分鐘，分離血清與血細胞，棄血細胞，將血清置于-80℃冰箱保存。

1.4 細胞培養

待所用培養的細胞中有90%左右已經生長，按4×103/cm2鋪1個96孔板，待細胞融合約50%時進行實驗；配置7種不同含藥血清成骨細胞誘導分化培養基，正常對照組，空白血清組，尪痹片高劑量組，尪痹片中劑量組，尪痹片低劑量組，仙靈骨葆膠囊組，甲氨蝶呤組，除了正常對照組，其他培養基中均加入濃度為3.125ng/ml的TNF-α溶液，每個藥物3個復孔，96孔板細胞棄上清，用1×PBS洗2～3次，加入100 μL/孔對應的含藥血清成骨細胞誘導分化培養基，放入37℃ 5% CO2恒溫培養箱培養；每隔2 d換一次液，第7 d取出細胞，進行各項檢測。

1.5 MTT法檢測細胞增殖率

取出96孔板，棄液，加入30 μL/孔MTT，37℃ 作用24 h，棄MTT，加入150 μL/孔 DMSO，37℃恒溫震蕩儀孵育15min測OD540，分析結果。增殖率%＝（1-（正常對照組OD值-實驗組OD值）/（正常對照組OD值-調零OD值））×100

1.6 茜素紅染色法檢測成骨礦化情況

①成骨誘導分化結束后，棄細胞培養基，室溫固定30 min；②棄4%多聚甲醛，用用1×PBS洗2次，每孔加入500μL茜素化結束后，棄細胞培養基，用1×PBS洗2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，紅染液染色3min；③棄茜素紅染液，用1×PBS洗3～5次，將培養板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

1.7 堿性磷酸酶測試盒測試堿性磷酸酶活性

原理：堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據紅色深淺可以測定酶活力的高低。檢測步驟：按照堿性磷酸酶測試盒說明書的操作方法進行。

2.統計學方法

3.結果

3.1 細胞增殖情況

如圖1和表1所示，與正常組相比較，其他各組的增殖率均低于正常組(P＜0.01)，空白血清組與尪痹片低劑量組的增殖率的差異沒有統計學意義(P＞0.05),尪痹片低劑量組較高、中劑量組高(P＜0.01)，仙靈骨葆組與甲氨蝶呤組的差異沒有統計學意義(P＞0.05)。

表1 7組MTT檢測細胞增殖率

圖1 MTT檢測細胞增殖率比較

2.2 成骨鈣化結節情況

茜素紅染色成骨細胞鈣化結節呈紅褐色,形狀多為圓形和橢圓形,少數為不規則形狀，由下圖2-圖8可見，尪痹片中劑量組（圖5）,尪痹片低劑量組（圖6）,仙靈骨葆組(圖7)的礦化結節相對其他組較多。空白血清組（圖3），尪痹片高劑量組（圖4），甲氨蝶呤組（圖8）的礦化結節比較少。

2.3 堿性磷酸酶活力情況

見表2所示，與正常對照組和空白血清組相比較，尪痹片低劑量組的AKP均值顯著高于前二組，差異具有統計學意義(P＜0.01），仙靈骨葆組與空白血清組的差異沒有統計學意義(P＞0.05)，甲氨蝶呤組與空白血清組之間的差異沒有統計學意義(P＞0.05)。

表2 7組細胞堿性磷酸酶檢測值

3.討論

細胞堿性磷酸酶活力和礦化結節的形成是成骨細胞早期和中晚期分化的標志,對BMSCs而言則是表明BMSCs骨向分化的特征[4]。本研究的模型為在成骨分化培養基中加入3.125ng/ml的腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α），是RA病程中最早產生的炎癥細胞因子之一，在發病機制中起主導作用,是炎癥瀑布的上游分子,通過作用于多種細胞在RA的滑膜炎癥、血管新生及骨質破壞中起重要作用[5]。RA患者的血清中TNF-α水平顯著上調，且與類風濕性關節炎的活動性呈顯著正相關[6]，在RA患者的關節液亦出現TNF-α的高表達[7]。本研究的結果提示，BMSCs細胞在炎癥因子和藥物的刺激之下，均出現了細胞增殖減少,尪痹片高，中劑量組對細胞增殖的阻礙作用比較大，尪痹片低劑量組對細胞增殖的阻礙作用比其他組低，甲氨蝶呤組和仙靈骨葆組均對細胞增殖有阻礙作用，但是其阻礙作用比尪痹片低劑量組要大。說明尪痹片的低劑量對細胞的毒性相對較小。在成骨分化標志物方面，尪痹片中劑量組表現出堿性磷酸酶活力增加，茜素紅染色的鈣化結節明顯增多。表明尪痹片中劑量組對TNF-α刺激下的成骨分化保護作用較尪痹片其他劑量，仙靈骨葆膠囊和甲氨蝶呤效果好。RA主要為炎癥性關節病，但是又以伴發骨代謝異常骨質疏松癥為特點，表現為關節周圍骨丟失及骨侵蝕、全身性骨質疏松癥,患者的骨折風險明顯增加[8]。骨質疏松的原因之一在于骨生成不足[9]，有報道稱尪痹片可以增加RA患者的骨密度以及骨鈣素、血清Ⅰ型膠原交聯 C 末端肽等血清成骨標志物。甲氨蝶呤并不能阻止骨質疏松的發生[10]。本研究的結果進一步證實了尪痹片具有促進骨生成的作用，同時揭示導致這種促進作用的一條可能的機制是促進BMSCs向成骨分化，能夠保護TNF-α刺激下的BMSCs仍然具有成骨分化能力。