美司鈉注射液細菌內毒素檢查法研究

馮亮 劉益慶

（1 江蘇省東海縣產品質量和食品安全綜合檢驗檢測中心藥理室 江蘇 連云港 222300）

（2 連云港市食品藥品檢驗檢測中心藥理室 江蘇 連云港 222000）

美司鈉注射液為預防環磷酰胺、異環磷酰胺、氯環磷酰胺等藥物的泌尿道毒性[1]?，F有的該品種檢測標準“中國藥典”2015年4期9301版“注射安全檢驗方法應用指南”[2]。有必要對該品種建立細菌內毒素檢測方法。細菌內毒素檢測方法快速，敏感，準確，符合3R原則[3-4]，逐步取代兔熱原試驗方法。本研究建立了美司注射液細菌內毒素檢查，大大提高了臨床用藥的安全性。

1.實驗材料

細菌內毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201885，效價：80EU/支)；鱟試劑(TAL，湛江安度斯生物有限公司，規格：0.1mL/支，批號：1710162，靈敏度：0.25EU·mL-1；湛江博康海洋生物有限公司，規格：0.1mL/支，批 號：1711092，靈敏度：0.25EU·mL-1)；細菌內毒素檢查用水(BET水，中國食品藥檢監督檢定研究院，規格：5mL/支，批號：160006-201704；美司鈉注射液（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：170126，規格：4ml：0.4g ；批號170312,規格：4ml：0.4g；批號170617，規格：4ml：0.4g）；儀器ZH-2BLENDER型旋渦混合器(天津藥典標準儀器廠)；MET-50 型智能恒溫儀(天大天發科技有限公司)；GZX-9146MBE型電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司)。

2.方法與結果

2.1 鱟試劑敏感性檢查

根據中國藥典，2015年版四部通則1143，鱟試劑敏感性試驗[5]，所測試的鱟試劑的靈敏度值均在0.5λ至2.0λ的范圍內，符合要求，見表1。

表1 鱟試劑敏感性試驗結果

2.2 樣品內毒素限制L的確定

細菌內毒素限量公式L=K/M，其中K是每人每公斤體重最大可接受的內毒素劑量，注射劑K=5EU·(kg·h)-1；每千克體重用于人體的M以小時計的最大劑量。

對照用藥說明書，該藥的常用劑量為20%環磷酰胺，異環磷酰胺，氯磷酰胺劑量，靜脈滴注或靜脈滴注，給藥時間為0小時（與細胞抑制劑同時），4小時后和8小時后，兒童的給藥頻率應相對較頻繁（例如6次），間隔時間較短（例如3小時）。

根據環磷酰胺注射規范，成人常用量：單藥靜脈注射體表面積500～1000mg/m2，加生理鹽水20～30ml，靜脈注射，每周一次，每次2次，休息1～2周，重復。人的體表面積按1.62m2計，注射用環磷酰胺最大劑量27mg/kg，美司鈉注射液最大劑量5.4mg/kg，K=5EU/Kg，L=K/M=5EU/Kg/5.4 mg/Kg=0.926EU/mg，由于該藥為聯合用藥，可嚴格至限值的1/2或者1/3，因此，限制設定為0.3EU·mL-1[6]。

2.3 干擾測試預實驗

凝膠法用于檢測細菌內毒素。鱟試劑的靈敏度為0.03～0.5 EU·mL-1，L=0.3EU·mL-1，試驗樣品用 BET 水制成 60,120,240,500，1000倍系列濃度的溶液，并將獲取的溶液作為試驗溶液（NPC），制備一系列含有2λ細菌內毒素的各稀釋比的試驗陽性對照溶液（PPC）。使用鱟試劑進行干擾預試驗，敏感度為0.25EU/mL-1。從表2中初步確定，三批Mesna注射液稀釋60倍，不干擾鱟試劑與內毒素的反應，見表2。

表2 美司鈉注射液細菌內毒素干擾試驗預試驗結果

2.4 正式干擾試驗

根據預測試結果，從不同批次中取出三批測試樣品，并用BET水稀釋1：60倍作為測試溶液。細菌內毒素工作標準分別由試驗溶液和BET水制成,使用濃度為2λ、λ、0.5λ和0.25λ的溶液，兩種不同制造商生產的靈敏度為0.25 EU·mL-1。根據《中國藥典》2015年版四部通則 1143細菌內毒素試驗凝膠法干擾試驗操作。不同批次的TAL和WSE反應之間沒有干擾,Mes注射鈉以1：60稀釋，見表3。

表3 美司鈉注射液細菌內毒素干擾試驗結果

2.5 標準建立

根據上述結果，可以建立美司鈉細菌內毒素檢驗標準。細菌內毒素：取本品并依法檢查(《中國藥典》2015年版四部通則 1143)，每1mg美司鈉的內毒素含量應小于0.3EU。

2.6 樣品檢測

根據本研究中建立的細菌內毒素檢查，取鱟試劑，靈敏度為0.25EU·mL-1。常規檢查三批美司鈉注射液，結果符合規定。見表4。

表4 美司鈉注射液細菌內毒素檢查結果表

3.討論

美司鈉注射液常用量為環磷酰胺、異環磷酰胺、氯磷酰胺劑量的20%，由于是聯合用藥，所以在限值上需要嚴格控制，期間根據注射用環磷酰胺和注射用異環磷酰胺的說明書，得出的理論限值為：注射用環磷酰胺＜注射用異環磷酰胺，所以選用注射用環磷酰胺的理論限值，最終確定為L=0.3EU·mL-1。

在干擾預實驗中，我們發現美司鈉注射液幾乎不存在干擾作用，所以選擇最小的稀釋倍數（1：60）作為干擾試驗的濃度進行正式干擾試驗。

由于該藥的標準既沒有細菌內毒素檢查項又沒有熱原檢查項，所以可以在兩者之間隨便選擇一項作為檢查項，綜合各種條件考慮，最終還是選擇細菌內毒素較為妥當。

查詢文獻，沒有找到美司鈉注射液的細菌內毒素檢查方法，該文建立的細菌內毒方法為：取本品并依法檢查(《中國藥典》2015 年版四部 1143)，每1mg美司鈉的內毒素含量應小于0.3 EU。