赤大袋鼠館氣載需氧菌分離鑒定及致病性分析

李俊嫻 李敏捷 李梅榮 程王琨

(1.南京紅山森林動物園，南京，210028；2.南京農業大學，南京，210095；3.成都產品質量檢驗研究院有限責任公司，成都，610100)

了解并分析赤大袋鼠(Macropusrufus)館空氣中細菌分布情況及污染程度，對空氣中細菌的種類以及是否存在致病菌株進行檢測可為袋鼠細菌性疾病的感染來源和防控提供參考依據。本試驗通過分析袋鼠館氣載需氧菌的種類及致病性，為提高動物園袋鼠生活環境質量、預防袋鼠細菌性疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 赤大袋鼠館籠舍結構及飼養密度

南京紅山森林動物園赤大袋鼠館飼養內舍共6間，為東西走向，南北兩側各3間，每間面積16 m2，中間由工作通道相連接。飼料間1間，面積為16 m2。運動場為露天場地，總面積約1 500 m2。飼養內舍和運動場之間有雨棚遮擋的緩沖道，緩沖道寬約1.5 m。該場館共飼養赤大袋鼠20只，每年均有繁殖。

1.2 材料

實驗動物：普通級小白鼠，6周齡，雌性，18—22 g，購自青龍山實驗動物基地。

主要試劑：瓊脂糖、核酸染料、DNA Marker DL2000、PCR反應成分為南京喏唯贊生物科技有限公司產品；引物由擎科生物技術有限公司合成；培養基及其他試驗試劑為天為生物技術有限公司產品和杭州百思生物技術有限公司產品。

1.3 方法

參照GB/T 18204.3—2013中華人民共和國國家標準公共場所衛生檢驗方法第3部分空氣微生物細菌總數測定中自然沉降法[1]的規定對袋鼠館的赤大袋鼠館進行布點采樣。春季采樣于4月進行，夏季采樣于7月進行，秋季采樣于10月進行，冬季采樣于1月進行。每個季度隨機挑選(雨雪天氣除外)3—5 d，于10：00—12：00分別在赤大袋鼠館的運動場、緩沖道、飼養內舍、工作通道和飼料間進行采樣。采樣時間10 min。培養后按奧梅梁斯基公式[2]計算菌落總數，以CFU/m3報告結果。

1.3.1 氣載需氧菌的分離與純化

每個采樣點放置甘露醇氯化鈉瓊脂(MSA)、麥康凱瓊脂(MAC)、志賀菌屬瓊脂(SS)及兔鮮血平板各1個。采用自然沉降法收集空氣細菌，10 min后蓋上平皿蓋，做好標記盡快轉移至實驗室37℃恒溫培養箱中，倒置培養48 h后觀察各培養基中的細菌形態。挑取各培養基上的典型菌落進行涂片，使用革蘭氏染色后鏡檢，初步區分細菌形態和革蘭氏染色性質后將初步分離的菌株接種至相應培養基上進一步純化，直至獲得純菌株。

1.3.2 分離菌的16S rRNA基因鑒定

按照SDS裂解-高鹽沉淀法提取細菌的DNA。以細菌基因組DNA為模板，PCR擴增16S rRNA基因。引物參考Kibe等[3]的通用序列，16S-F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S-R 5′-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3′。取PCR反應擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。將電泳結果只有1條清晰條帶且產物大小接近1 500 bp的PCR產物送至金唯智生物技術有限公司進行純化測序，將測得的細菌16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中的基因序列進行對比分析。

1.3.3 分離菌的生化鑒定

將MAC和SS培養基上挑出的革蘭氏陰性的氧化酶陰性、發酵葡萄糖的桿菌進行腸桿菌科(Enterobacteriaceae)生化鑒定。將MSA及血平板上挑出的革蘭氏陽性觸酶陽性，氧化酶陰性的球菌做葡萄球菌屬(Staphylococcus)生化鑒定。將血平板上挑出的觸酶陰性的細菌做鏈球菌屬(Streptococcus)生化試驗。將各菌株的生化鑒定結果與《伯杰細菌鑒定手冊》中相應的生化結果對照，以生化結果最接近的菌種作為鑒定結果。

1.3.4 動物致病性試驗

根據分離菌的16S rRNA測序比對以及生化鑒定結果，從分離的不同菌種中挑選適當數量的菌株進行動物致病性試驗。采用活菌培養計數法計數細菌濃度后將試驗菌用無菌生理鹽水稀釋至9×108CFU/mL[4-5]，以0.3 mL/只的量腹腔注射小白鼠，每種細菌做3個重復。對照組小白鼠腹腔注射滅菌生理鹽水。接種后觀察小白鼠的活動及發病情況，對死亡小白鼠立即剖檢。觀察病變并挑取肝臟組織劃線培養，進行細菌再分離和鑒定工作，若與注入細菌相同則判定為病原菌。未發病的繼續觀察至1周后統一處死觀察病變并進行肝臟組織劃線培養，觀察是否有細菌生長。

1.3.5 致病菌株抗生素敏感性分析

試驗方法參照臨床微生物檢驗標準化操作[6]進行，根據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗中的M100—S20標準解釋結果[7]。

以大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC25922和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923作為質控菌株，選擇阿米卡星(AK)、阿莫西林/克拉維酸(2∶1)(AMC)、阿奇霉素(AZM)、頭孢哌酮(CFP)、氨芐西林/舒巴坦(1∶1)(SAM)、頭孢西丁(FOX)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻呋(EFT)、環丙沙星(CIP)、克林霉素(DA)、恩諾沙星(ENR)、紅霉素(E)、氟苯尼考(FFC)、慶大霉素(CN)、磺胺甲基異惡唑/甲氧芐胺嘧啶(SXT)，共計15種藥物進行試驗。腸桿菌科、葡萄球菌屬及鏈球菌屬致病菌根據動物園常用藥物及CLSI建議使用藥物分別選擇不同類藥物。

2 結果

2.1 赤大袋鼠館氣載需氧菌的四季濃度監測結果

從赤大袋鼠館測定的氣載需氧菌濃度結果見表1。

表1 赤袋鼠館的氣載需氧菌濃度

Tab.1 The concentration of airborne aerobic bacteria in the red kangaroo exhibition

注：表中氣載需氧菌濃度的單位為103CFU/m3。同列肩標大寫字母不同表示差異顯著，同行肩標小寫字母不同表示差異顯著

Note：The unit of airborne aerobic bacteria is 103CFU/m3.Different capital letter superscripts in the same column show significant difference，different lowercase superscripts in the same line show significant difference

相同季節不同區域之間的菌濃度比較結果為：除夏季工作通道和飼料間兩個區域之間菌濃度差異不顯著外，春、夏、秋、冬4個季節赤大袋鼠館的運動場、緩沖道、飼養內舍、工作通道及飼料間5個區域之間的菌濃度均存在顯著性差異。赤大袋鼠館5個區域中夏季飼養內舍菌濃度最高，秋季飼料間菌濃度最高。

相同區域不同季節之間的氣載需氧菌濃度對比結果為：運動場夏季菌濃度最高，冬季最低，春、秋、冬三季菌濃度不存在顯著性差異；緩沖道夏季菌濃度最高，冬季最低，春、秋兩季菌濃度不存在顯著性差異，但其他季節之間菌濃度差異顯著；工作通道和飼料間菌濃度春、冬兩季差異不顯著，且菌濃度最低，其他季節之間菌濃度差異顯著，工作通道夏季菌濃度最高，飼料間秋季菌濃度最高；飼養內舍春、夏、秋、冬4個季節菌濃度差異不顯著。赤大袋鼠館5個區域中除了飼料間秋季菌濃度比夏季高以外，其他區域夏季氣載需氧菌濃度均顯著性地高于其他季節。

2.2 分離菌的種類與占比

經生化鑒定及16S rRNA比對結果分析可以得出，本次試驗鑒定三大類細菌共計71株(表2)，其中葡萄球菌屬細菌最多，共8種37株，占分離菌的52.1%，其中馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)的分離率14/37顯著高于其他葡萄球菌，為赤大袋鼠館空氣中葡萄球菌屬的優勢菌種。分離到腸桿菌科細菌9個屬，10種菌，共計31株，占分離菌的43.7%，其中大腸埃希菌占比最多，為袋鼠館空氣中腸桿菌科細菌的優勢菌種。鏈球菌屬細菌僅分離到2種3株，占分離菌的4.2%。在71株菌中，從飼養內舍分離的細菌有44株，其他區域共分離到27株，飼養內舍細菌分離率為62.0%，其他區域細菌分離率為38.0%。飼養內舍環境中腸桿菌科、葡萄球菌屬、鏈球菌屬的細菌含量明顯高于舍外環境。

表2 分離菌種類與占比

Tab.2 The species and percentage of isolated bacteria

2.3 致病菌株篩選結果

對株菌進行致病性觀察試驗，分離鑒定結果顯示分離菌中馬胃葡萄球菌分離率明顯高于其他菌種，從中隨機選擇8株馬胃葡萄球菌同其他所有菌株一起，共計65株菌進行致病性觀察試驗。以菌懸液接種小白鼠后，菌株SA30、CS5、CX11、XL9、CM3、CM34導致小白鼠不同程度發病及死亡(表3)。小白鼠于接種后6 h出現精神萎靡，蜷縮不動，飲食活動減少等癥狀，其中CM3、CM34組小白鼠飲水稍有增加，墊料中可見少量稀便，發病后期部分小白鼠眼部見大量黏液。部分小白鼠于接種24—72 h內死亡，死亡前被毛逆立，有的出現全身戰栗現象。其他小白鼠于接種72 h后逐漸恢復健康。剖檢死亡小白鼠發現CS5組部分小白鼠脾臟腫大，CM3、CM34組小白鼠十二指腸充滿黃色膿性液體，腸黏膜出血明顯，見腹水。SA30、CX11組部分小白鼠肝臟腫大，有出血點，腎臟出血明顯。XL9組死亡小白鼠肝臟有不明顯出血點，肺和腦均見明顯出血。無菌采集死亡小白鼠肝臟組織進行劃線培養，發現沿劃線處有大量細菌長出，經鑒定與原接種菌一致。

表3 小白鼠發病及死亡情況

Tab.3 The morbidity and mortality of mice

除上述分離菌接種小白鼠出現明顯發病及死亡癥狀以外，其他組分離菌及對照組小白鼠在接種后部分出現精神沉郁現象，但12 h后均無發病癥狀，且在1周的觀察期內均未見明顯的發病癥狀。將所有未死亡小白鼠處死后剖檢，均未見明顯病理變化，肝臟組織劃線培養均未見細菌生長。

由此可知，在分離得到細菌中，2株大腸埃希菌CM3、CM34，1株弗氏志賀菌(Shigellaflexneri)CS5，2株金黃色葡萄球菌SA30、CX11及1株巴黎鏈球菌(Streptococcuslutetiensis)XL9，共計6株菌判定為致病菌。其他菌株判定為非致病菌或者致病力較弱的菌株。篩選出的致病菌全部分離自飼養內舍。

2.4 致病菌株的抗生素敏感性分析結果

試驗結果顯示質控菌大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923對試驗藥物的抑菌圈大小均在規定值以內，證明此次試驗菌的抗生素敏感性試驗結果有效。6株試驗菌的抑菌圈大小及敏感性結果判定見表4。

表4 致病菌株的藥敏結果

Tab.4 The antimicrobial susceptibility testing results of pathogenic strains

注：表中S表示敏感，I表示中介，R表示耐藥，-代表未測，/代表未出現抑菌圈

Note：S indicates sensitivity，I indicates intermediary，R indicates resistance，- indicates no detection，/ indicates no inhibition zone

由表結果可知，分離的6株致病菌均對克林霉素耐藥，對環丙沙星、氟苯尼考、慶大霉素、恩諾沙星和磺胺甲基異惡唑敏感。此外，不同菌株對不同藥物存在不同程度的耐藥情況。

3 討論

3.1 消毒管理及籠舍設計建議

綜合分析結果可見，赤大袋鼠館飼養內舍和飼料間這兩個室內區域氣載需氧菌濃度明顯高于其他區域。袋鼠舍空氣中菌含量高可能是因為飼養內舍常有袋鼠活動，夜晚袋鼠聚集于舍內密度較大，排泄物堆積，室內環境空氣流動受限造成；飼料間空氣菌含量高可能是因為飼料間堆放飼料，通風不暢，且因控制環境濕度和防止飼料污染等原因無法使用液體消毒劑，同時缺乏其他消毒設施，較少進行消毒工作造成。赤大袋鼠館各個區域一年四季氣載需氧菌濃度與溫度呈正相關。

建議赤大袋鼠館在日常管理工作中重點關注細菌污染較嚴重的飼養內舍及飼料間，及時清掃飼養內舍飼草及排泄物，根據不同季節菌濃度的特點適當調整消毒頻率。貯存飼料時不宜將飼料間堆放得過滿。建議將飼料擺放于不易霉變的塑料墊板上。應避免將品質不佳的飼料貯存于飼料間內。

根據赤大袋鼠喜歡干燥的自然習性，以及本試驗檢測結果，袋鼠籠舍設計過程中，建議將飼養內舍建設于干燥、光照充足且通風良好的地方。以減少袋鼠感染致病菌的機會。在場地允許的前提下，適當提高飼養內舍的面積，不僅為動物提供更好的福利，也為降低菌濃度提供硬件條件。建議對飼料間安裝溫度和濕度控制系統，并安裝紫外燈或者臭氧機等消毒設備。在飼料間安裝排風扇等強制通風設備，以備在環境條件適宜的時候加強飼料間的通風。

3.2 提高動物抵抗力，減少條件性致病菌感染

本試驗在赤大袋鼠館中分離出腸桿菌科、葡萄球菌屬、鏈球菌屬三大類細菌共計71株。其中44株分離自飼養內舍，分離率為62.0%。對分離的細菌進行致病力觀察試驗判定2株大腸埃希菌，1株弗氏志賀菌，2株金黃色葡萄球菌及1株巴黎鏈球菌，共計6株菌為致病菌。上述6株菌均為條件性致病菌，且全部分離自飼養內舍。飼養內舍是赤大袋鼠避風取暖的主要場所，故這些條件性致病菌與赤大袋鼠接觸幾率大，相對接觸時間長，引起動物發病的可能性高。在圈養過程中維持飼養環境的相對安靜，控制并減少引起動物應激的外在因素，提供合理的飼料，選擇合理的管理方式，滿足動物的需求，提高動物福利可以一定程度上提高動物的抵抗力，減少條件性致病菌的感染。

3.3 抗菌藥物的選擇和使用

赤大袋鼠館空氣中的致病菌存在耐藥的情況，金黃色葡萄球菌及巴黎鏈球菌出現多重耐藥現象，特別是巴黎鏈球菌的耐藥現象最為嚴重。在袋鼠患細菌性疾病時，可優先考慮選擇環丙沙星、氟苯尼考、慶大霉素、恩諾沙星和磺胺甲基異惡唑等藥物進行治療，并同時進行病原菌分離鑒定及藥敏試驗，根據藥敏試驗的結果對治療藥物進行適當調整，以避免不合理地使用抗菌藥物。應堅持能用低級別抗菌藥窄譜抗菌藥時就不用高級別廣譜抗菌藥，盡可能做到精準使用抗菌藥，減少使用抗菌藥。