貉源致病性肺炎克雷伯氏菌對喹諾酮類藥物耐藥表型及耐藥基因檢測

張召興 劉少杰 蘇碩青 周 琦 賈青輝 張艷英 史秋梅*

(1.河北旅游職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系，承德，067000；2.河北科技師范學院/河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，秦皇島，066604；)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)常見的病原菌之一，該菌主要引起毛皮動物的肺炎、子宮炎及其他化膿性炎癥等，其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，僅次于大腸桿菌(Escherichiacoli)感染，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴重影響著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]。肺炎克雷伯氏菌廣泛分布于動物呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及水和土壤中，該菌可引起歐洲水貂(Mustelalutreola)、貉(Nyctereutesprocyonoides)、狐(Vulpesspp.)、牛、羊等多種動物及人(Homosapiens)發(fā)病，是一種重要的人畜共患的條件致病菌[3]。相關(guān)研究表明肺炎克雷伯氏菌通過接合，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導等形式對多種抗生素產(chǎn)生很強的耐藥性，并且在同種菌株間進行傳播，使其耐藥性擴散到其他菌株中，致使該菌呈現(xiàn)多重耐藥性[4]。目前，關(guān)于肺炎克雷伯氏菌耐藥性的報道逐漸增多，應該引起重視。

喹諾酮類藥物為人工合成的廣譜類抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有較好的抑菌效果，具有抗菌譜廣、抗菌作用明顯、安全性較高等多種優(yōu)點，被廣泛應用于畜禽細菌性疾病的防治中，隨著喹諾酮類藥物在臨床中不合理的使用，導致許多病原菌對該類藥物產(chǎn)生很強的耐藥性[5]。相關(guān)研究表明細菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生的耐藥性與其攜帶的耐藥基因具有一定的相關(guān)性[6]。研究喹諾酮類藥物耐藥機制，減少該類藥物耐藥性具有很重要的意義。本試驗以臨床中分離的貉源致病性肺炎克雷伯氏菌為研究對象，對喹諾酮類藥物的耐藥性與耐藥基因進行檢測，并分析相關(guān)性，探討其對喹諾酮類藥物的耐藥機制，為貉肺炎克雷伯氏菌病的防控提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌臨床分離菌株，由河北省預防獸醫(yī)重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素培養(yǎng)基(MIAC)均購于北京陸橋生化試劑有限公司；左氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星藥敏紙片均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；DNA Marker 2000購于北京中科瑞泰生物科技有限公司；2×ESTaqMaster Mix、ddH2O均購自北京康為世紀生物科技有限公司；梯度PCR儀由德國eppendorf公司生產(chǎn)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科學儀器有限公司生產(chǎn)；常用的試劑和儀器設備由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌種復蘇

將保存于-80 ℃的致病性肺炎克雷伯氏菌接種于麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素培養(yǎng)基(MIAC)上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取單個菌落于裝有5 mL營養(yǎng)肉湯的10 mL管中，37 ℃進行擴大培養(yǎng)至對數(shù)期。

1.2.2 藥敏試驗

取對數(shù)期的菌株，調(diào)整菌液濃度為106CFU/mL，參照CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)推薦的K-B藥敏紙片法對24株致病性肺炎克雷伯氏菌進行藥物敏感性試驗，抑菌圈直徑結(jié)果判斷以細菌敏感(sensitivity，S)、中介(intermediate，I)、耐藥(resistance，R)表示。

1.2.3 細菌基因組DNA的提取

利用水煮法提取，取菌液1 000 μL離心，水洗兩遍，加200 μL無菌水放入水浴鍋100℃，10 min，取出后離心12 000 r/min，10 min留上清液，備用。

1.2.4 引物設計

參考文獻[7]，設計喹諾酮類耐藥基因的引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 喹諾酮類耐藥基因的引物序列

Tab.1 Primer sequences of quinolone resistance genes

1.2.5 耐藥基因的PCR檢測

以提取的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌臨床分離菌株基因組DNA為模板對9種喹諾酮類藥物的耐藥基因用降落PCR進行檢測。反應體系(50 μL)：2×EsTaqMaster Mix 20 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板4 μL，ddH2O 12 μL；反應條件：預變性：94℃5 min，94℃變性30 s，退火(見表1)℃45 s，72℃延伸70 s，72℃終延伸10 min，30 Cycles。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，將檢測結(jié)果為陽性的菌株的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

將24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌臨床分離菌株對喹諾酮類藥物耐藥性與攜帶耐藥基因進行統(tǒng)計，分析其相關(guān)性，計算其符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹諾酮類藥物耐藥性檢測結(jié)果

由表2藥敏試驗結(jié)果可知，24株致病性肺炎克雷伯氏菌對4種抗生素有很強的耐藥性。其中左氧氟沙星的耐藥性、恩諾沙星與環(huán)丙沙星耐藥性均為79.2%(19/24)，諾氟沙星耐藥性為75%(18/24)。

表2 24株致病性肺炎克雷伯氏菌對4種喹諾酮類藥物的藥敏結(jié)果

Tab.2 Drug sensitivity of 24 strains of pathogenic Klebsiella pneumoniae to four quinolones

由表3可知，臨床分離的24株致病性肺炎克雷伯氏菌的菌株表現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，耐4種抗生素的分離菌株數(shù)最多有16株，占分離菌株的66.7%；耐3種抗生素的分離菌株有2株，占分離菌株的8.3%；耐2種抗生素的分離菌株有3株，占分離菌株的12.5%；耐1種抗生素的分離菌株有1株，占分離菌株的4.2%，2株未產(chǎn)生耐藥性，占分離菌株的8.3%。

表3 24株致病性肺炎克雷伯氏菌的多重耐藥檢測結(jié)果

Tab.3 24 multidrug resistance test results of pathogenic Klebsiella pneumoniae

2.2 喹諾酮類藥物耐藥基因檢測結(jié)果

臨床分離的24株致病性肺炎克雷伯氏菌的菌株攜帶多種耐藥基因，9種喹諾酮類抗生素耐藥基因均被檢測到(圖1)。24株致病性肺炎克雷伯氏菌的菌株耐藥基因測序結(jié)果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的同源性均在98.9%以上。耐藥基因gyrB、oqxA檢出率為100%，耐藥基因gyrA、parC、parE、oqxB、ompF檢出率為70.8%—79.2%，耐藥基因qnrA、ompC檢出率為12.5%—20.8%(表4)。

圖1 致病性肺炎克雷伯氏菌耐藥基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of drug resistance genes of pathogenic Klebsiella pneumoniae 注：M：D2000 DNA Maker；1-9：Resistance genes oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、parC、parE、ompC、ompF、qnrA

由表5可知，24株致病性肺炎克雷伯氏菌的分離菌株均含有多重耐藥基因，其中含有9、8、5、3種耐藥基因的分離菌株各1株，占分離菌株的7.7%；含有7種耐藥基因的菌株為10株，占分離菌株的76.9%；含有6種耐藥基因的菌株有6株，占分離菌株的46.2%；含有4種耐藥基因的菌株有4株，占分離菌株的30.8%。

2.3 喹諾酮類藥物耐藥性與耐藥基因檢測相關(guān)性分析

通過對臨床分離的24株致病性肺炎克雷伯氏菌株進行耐藥表型及耐藥基因進行相關(guān)性分析。由表6可知，左氧氟沙星藥物與耐藥基因oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、parC、parE符合率為68.4%—100%，與耐藥基因ompC、ompF、qnrA符合率較低；恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星3種藥物與 耐藥基因oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、parC、parE、ompF符合率為63.2%—100%。與耐藥基因ompC、qnrA符合率較低。

表4 57株致病性肺炎克雷伯氏菌耐藥基因檢測結(jié)果

Tab.4 57 drug resistance genes of Klebsiella pneumoniae

表5 24株致病性肺炎克雷伯氏菌的多重耐藥基因結(jié)果

Tab.5 24 multidrug resistance gene results of pathogenic Klebsiella pneumoniae

表6 喹諾酮類藥物的耐藥表型與耐藥基因符合率結(jié)果

Tab.6 Results of coincidence rate between drug resistance phenotype and drug resistance gene of quinolones %

3 討論

肺炎克雷伯氏菌屬于克雷伯氏菌屬一種革蘭氏陰性菌，該菌主要分為有肺炎克雷伯菌肺炎亞種、肺炎克雷伯菌鼻硬結(jié)亞種、肺炎克雷伯菌臭鼻亞種3個亞種，其中肺炎克雷伯菌肺炎亞種是臨床中常見的病原菌[8]。肺炎克雷伯氏菌主要引起毛皮動物的肺部感染，造成嚴重呼吸道癥狀，同時還可以破壞其免疫系統(tǒng)，導致免疫器官化膿，降低其免疫力，繼發(fā)其他的病原感染，其死亡率高達80%以上，成為引起毛皮動物肺炎主要病原菌之一[9-10]。國內(nèi)許多研究報道了隨著抗生素的廣泛應用，肺炎克雷伯氏菌對各類抗生素產(chǎn)生了較為嚴重的耐藥性[11]。本試驗研究表明，臨床分離的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌對喹諾酮類藥物左氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星出現(xiàn)嚴重的耐藥性，其耐藥性為70.8%—79.2%，且呈現(xiàn)多重耐藥性，其中耐4種抗生素的菌株有16株，占分離菌株的66.7%。說明了臨床分離的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌對喹諾酮產(chǎn)生很強的耐藥性，可能由于臨床中不合理使用喹諾酮類藥物造成的，應該引起重視。與韓坤等[1]、李巧玲等[9]、胡偉等[12]報道的存在一定的差異性，可能與肺炎克雷伯氏菌感染的宿主(藍狐(Vulpeslagopus)、水貂、人)不同，對喹諾酮類藥物敏感性不同，還可能與地區(qū)有關(guān)。

喹諾酮類藥物的耐藥性機制與其藥物的主動外排、產(chǎn)生抗生素水解酶、生物被膜形成、gyrA和parC基因變異、外膜孔蛋白缺失等多種機制有關(guān)[7]。隨著抗生素的過度使用，在抗生素藥物選擇壓力下，改變喹諾酮類藥物的耐藥性機制，致使肺炎克雷伯氏菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性。相關(guān)研究表明了氟喹諾酮類藥物耐藥性與攜帶的耐藥基因有關(guān)[7，11-12]。本試驗研究表明，24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌的耐藥基因gyrB、oqxA、parC、parE、oqxB、ompF檢出率在70.8%以上，其他耐基因檢出率為12.5%—20.8%，同時攜帶7、6種耐藥基因的菌株最多，分別占分離菌株的76.9%、46.2%。說明分離的24株貉源致病性肺炎克雷伯氏菌攜帶多種耐藥基因，通過分析，左氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星表型與耐藥基因oqxA、oqxB、gyrB、parC、parE的符合率為78.9%—100%，其耐藥表型與耐藥基因之間具有一定相關(guān)性。進而證實肺炎克雷伯氏菌的耐藥性產(chǎn)生攜帶的耐藥基因(oqxA、oqxB、gyrB、parC、parE)有關(guān)，有待進一步研究。本試驗為貉肺炎克雷伯氏菌病的防控提供研究基礎(chǔ)。