福氏志賀氏菌與蛔蟲混合感染引起的池鷺死亡病例診斷

肖望成 楊 勇 魯紅林 李 娟 于 鑒 李 朝段 綱 曾 成* 曾邦權 段博芳 代飛燕*

(1.云南省高校獸醫公共衛生重點實驗室，云南農業大學動物醫學院，昆明，650201；2.昆明市瀕危動植物收容拯救中心，昆明，651700；3.云南省動物疫病預防控制中心，昆明，650201)

池鷺(Ardeolabacchus)又稱紅毛鷺、中國池鷺等，屬鷺科(Ardeidae)池鷺屬，典型的涉禽類。通常無聲，有時會發出低沉的呱呱叫聲。世界上的鷺科鳥類共有17屬60種118個亞種，其中池鷺屬有6個種2個亞種；我國鷺科鳥類共有9屬20種18個亞種，但是池鷺屬只有1個，無亞種[1-2]。池鷺分布范圍廣泛，主要分布在孟加拉國、中國、東南亞等地區，在中國主要分布在長江流域以及河北、青海、陜西南部、吉林省等地區[3]。池鷺屬我國國家Ⅱ級保護動物，生活在我國長江以南流域，喜在山腳灌木竹群間靠近河流水源地群居，集群于水域周圍高大的喬木營巢[4]。作為南方分布較廣的濕地鳥，主要以魚類為食，蛙類和昆蟲為輔[5]。云南省昆明市滇池是主要的越冬水禽主要聚集地，據涂文姬等在2015—2016年調查發現，滇池越冬的鳥類從種屬上來看有22%鷺科，其中池鷺為留鳥(替代型遷徙候鳥)中的稀有種[6-7]。池鷺不僅具有較高的觀賞價值，同時對林業有一定影響，其繁殖地的變更可作為良好環境變化的指標[8-9]。目前國內關于鷺鳥的研究主要集中在其繁殖生態，食物多樣性，地方物種多樣性，血液指標分析。

福氏志賀桿菌(ShigellaflexneriCastellani)系腸桿菌科(Enterobacteriaceae)志賀桿菌屬中的乙群革蘭陰性兼性厭氧菌。該菌能夠通過侵襲并穿透腸黏膜上皮細胞，引起人和其他動物典型的菌痢癥狀，具有高度傳染性和危害性，臨床表現為發熱﹑腹痛腹瀉﹑腸痙攣﹑血便等，治療不及時會出現肺炎、敗血癥等并發癥。引起人類感染僅需少量志賀菌(10—100個)[10]。在全世界范圍內，每年大約有2億人口感染，100多萬人死亡，其中50%—70%是由福志賀桿菌引起的。先后有志賀菌感染食蟹猴(Macacafascicularis)、牛(Bovine)、家兔(Lepus)等的報道，但關于野生動物的報道很少[11-13]。許蘭菊等[14]首次報道志賀氏菌在我國雞上的感染主要表現為腹瀉癥狀，剖檢病變為嚴重的腸道出血；王潤錦等[15]在腹瀉的藏雞病料中分離到兩株福氏志賀桿菌。另外志賀桿菌也極易產生耐藥性，并呈現多藥耐藥的特點[16]

蛔蟲(Ascaris)主要寄生在宿主的胃腸道內，能引起宿主生長發育緩慢、消瘦、腹痛、腹瀉等癥狀，嚴重時可能造成腸梗阻導致死亡，嚴重危害著人和動物的健康[17-18]。黃威[19]在長江中下游越冬白頭鶴(Grusmonacha)腸道寄生蟲多樣性研究發現，在感染的樣本中，含有1種和2種寄生蟲的樣本檢出率最高，感染率最高的為艾美爾球蟲，其次為禽蛔蟲；黃超等[20]在動物園綠孔雀(Pavomuticus)腸道寄生蟲流行特征調查中發現，球蟲的感染率達64.58%，蛔蟲感染率為22.50%，且隨季節呈現動態變化，散養的感染強度多于圈養 1 個“+”。蛔蟲是一種土源性寄生蟲，隨糞便和土壤傳播，生活史簡單，在一定的溫度、濕度和空氣等條件下蛔蟲卵容易發育為感染性蟲卵，且蟲卵具有較強的抵抗力，能在土壤里存活很久，因此會導致宿主反復感染，且感染率較高[21-22]。池鷺又通常喜歡棲息于水域附近，且食性主要以動物性食物為主，因此，池鷺在飲食和飲水的時候易吞食感染性蟲卵，從而感染蛔蟲病。故試驗探究一例池鷺死亡病例，為我們做好野生動物的預防保護工作提供依據，也為池鷺的研究提供科學素材。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年5月云南昆明市西山區死亡池鷺，無菌采集腸內容物和寄生蟲。普通瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、血瓊脂培養基、普通肉湯均由云南農業大學動物醫學院的公共平臺實驗室配制提供，并經檢驗合格。藥敏紙片、生化鑒定管購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌的分離培養及細菌形態觀察

取腸內容物，用劃線接種法接種于普通肉湯里，置于37 ℃ 恒溫培養箱中，培養12—24 h，進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細菌形態。根據菌落形態及顯微鏡觀察結果再挑取單個典型菌落劃線接種于普通瓊脂平板37 ℃進行純化培養[18]。

經分離得到的純培養物用劃線接種法分別接種于麥康凱瓊脂培養基和10%綿羊血脫纖維瓊脂培養基(由云南農業大學動物醫學院配制并檢驗合格)上置于37 ℃恒溫培養箱中，培養16—24 h，觀察菌落形態及在各種培養基上的生長情況。將純培養后的菌落，進行革蘭氏及瑞氏染色。

1.3 生化試驗

參照文獻[18]，將純培養后的菌落接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖等20種生化管。37 ℃培養24—48 h，觀察其生化特性。

1.4 分子生物學鑒定

分離純化細菌后，抽提基因組DNA利用細菌16S rDNA通用引物擴增16S rDNA基因片段[19]。以新鮮培養的菌液為模板，采用細菌16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，對菌株的16S rDNA進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL，預混DNA聚合酶12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據通用型DNA純化回收試劑盒說明書回收目的條帶。將膠回收產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果提交到NCBI的BLAST檢索系統進行序列比對，找到同源性最高的幾個序列，確定分離細菌屬，尋找同源性最高的細菌，下載該屬的序列，用DNAstar構建系統進化樹。參考菌株信息見表1。

表1 參考菌株信息

Tab.1 Reference strain information

1.5 寄生蟲檢測

取大約2 g左右的糞便置于一個小燒杯中，先在燒杯中加入少量飽和食鹽水，用玻璃棒將糞便攪拌調勻，然后向燒杯中加入約為糞便10倍量左右的飽和食鹽水，并用玻璃棒攪拌均勻，用40目的銅絲篩將糞樣過濾到青霉素小瓶內，在瓶口輕輕蓋一個載玻片，不能產生氣泡，每組做3份平行，濾液靜置約15—20 min左右，此時比飽和食鹽水比重輕的蟲卵大多浮于液體表面，然后將載玻片提起進行鏡檢。

取5條形態相同蟲體，命名為XC1，將蟲體放置在1.5 mL的離心管內剪碎，分別加入200 μL緩沖液GA與20 μL蛋白酶K，然后將樣品置于56 ℃的水浴鍋里消化過夜。按DNA提取試劑盒里的使用說明書提取蟲體基因組總DNA，然后將其保存在-20℃下。

參照Gasser等[23]設計的引物擴增此線蟲的COX1基因，預期擴增的目的片段的大小約450 bp，上游引物JB3(5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)，下游引物JB4.5(5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′)。引物合成于上海生物工程股份有限公司。從這5份池鷺消化道線蟲樣品提出的總DNA中，經PCR擴增出每份樣品的pCOX1片段，反應擴增體系在25 μL下進行，預混DNA聚合酶12.5 μL，模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。同時設陽性和陰性對照。取7 μL PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳儀上檢測，檢測結果通過紫外透射儀拍照記錄[21]。每份樣品經PCR鑒定后為陽性的PCR產物送測序公司進行雙向測序，然后將測序結果用SeqMan 5.01軟件進行拼接。序列拼接成功后將其上傳至NCBI-GenBank，用Blast與GenBank中已公布的線蟲pCOX1基因序列進行在線比對分析。

2 結 果

2.1 分離培養

純化后分離出1菌株在血平板上生長良好，經37 ℃培養24 h后，在血平板上出現邊整齊、表面光滑、灰白色菌落。在普通營養瓊脂上形成圓形突起、光滑、濕潤、半透明，灰白色、邊緣整齊的，中等偏大的菌落，直徑為2—3 mm；在伊紅美藍培養基上形成無色菌落；在麥康凱培養基上形成無色菌落，在顯微鏡下可以觀察到大量的革蘭氏陰性桿菌，初步懷疑為志賀氏菌。

2.2 生化試驗

分離菌的生化結果如表2。據生化結果可初步判XJ為志賀氏菌屬。

2.3 分子生物學鑒定

16S rDNA 測序，將獲得的16S rDNA 基因序列與 GenBank中登錄細菌16S rDNA進行比對，表明該分離菌16S rDNA 基因序列與已發表的志賀氏菌的16S rDNA基因同源性較高，達98%以上，由圖1可知，目的基因片段大小為1 500 bp，與理論值一致，且與鏡檢和生化試驗鑒定結果一致，證明該菌屬為志賀氏菌。將該分離株與參考菌株16S rDNA 序列進行比對分析，顯示該株福氏志賀桿菌與江蘇分離株EU409294.1屬于同一分支，與墨西哥分離株LC318444.1親緣關系較近(圖2)。

表2 分離菌株生化鑒定結果

Tab.2 Biochemical identification results of isolated strains

注：+為陽性反應，-為陰性反應

Note：+ Means positive，-Means negative

圖2 16S rRNA系統進化樹Fig.2 16S rRNA phylogenetic tree

2.4 寄生蟲檢測結果

將PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，我們可以從電泳圖見約443 bp的條帶(圖3)，與我們所預期的目的片段的大小差異并不大，且沒有特異性條帶出現。將池鷺消化道線蟲COX1的有效序列用NCBI數據庫中的Blast比對分析，該序列與GenBank上已公布的弓首屬(Toxocara)的牛弓首蛔蟲(Toxocaravitulorum)的相似率為90%，該比對結果表明所檢獲的池鷺消化道線蟲屬于蛔目(Ascaridida)弓首科(Toxocaridae)蛔蟲。

圖3 池鷺線蟲COX1 mtDNA的PCR擴增產物Fig.3 PCR amplication of nematode mtDNA COX1 from Ardeola bacchus 注：M：DL2000DNA Marke；1、3：陰性對照；2：陽性對照；4：XC Note：M：DL2000DNA Marke.1 and 3：Negative control.2：Positive control.4：XC

3 討論

志賀氏菌常引發細菌性痢疾，通稱為痢疾桿菌，并且其在自然界中分布較為廣泛，經常會導致細菌性痢疾，具有高度傳染性，人類對志賀氏菌易感[10]，這對人類和動物健康都造成嚴重的影響[12]。分析云南省昭通市細菌性痢疾流行特征發現，1964—2005年昭通市細菌性痢疾病例中福氏志賀菌檢出率平均占 88.66%，除1985年占57.57%，其他年度均在83%以上，可見本地區主要流行菌群以福氏志賀菌為主[24]。一般來說，福氏志賀氏菌所致菌痢的病情較重，排菌時間長，易轉為慢性。這樣患病動物攜帶致病菌，更容易通過糞便污染水源，進而威脅到人類健康。志賀氏菌能夠在潮濕土壤中生存34 d，37 ℃水中生存20 d，在糞便內(室內溫度)生存11 d。滇池水域是昆明最大的流動水域，也是池鷺活動最頻繁的區域，在此水域中，福氏志賀氏菌對昆明市民的健康有潛在的威脅[25]。人在接觸可能攜帶福氏志賀菌的糞便或食用含有的食品和飲水后，細菌在胃部酸性環境中生長，穿過小腸后到達結腸，侵入結腸黏膜引起急性壞死性結腸直腸炎，會表現為突然的水樣、黃色、粉紅色膠胨狀的腹瀉，伴有高熱、廢食、精神不振，排黏液血便，有的出現全身毒學癥癥狀，嚴重者可有感染性休克和(或)中毒性腦病，病情遷延不愈成為慢性或可反復發作。關于志賀氏菌專門侵襲直腸和結腸黏膜的機理還不清楚，有學者認為是由于直腸和結腸黏膜在志賀氏菌存在的情況下對急性水腫異常敏感導致的，Sansonetti等則推測志賀氏菌表飼導致的，志賀氏菌標記到達一個結腸特定的黏附系統[26]。所有已報道該病病例僅局限在腸黏膜。但筆者認為，志賀氏菌病從宿主自身來看，可以認為是由于宿主在侵襲性微生物存在時對水腫調節作用失衡的一種痢疾表現。

蛔蟲是寄生于多種脊椎動物小腸內的大型線蟲，不需要中間宿主而隨土壤傳播，其蟲卵在土壤中能夠長期存活，當動物不小心攝食被感染性蟲卵污染的飲水和食物時就會感染蛔蟲，引起蛔蟲病。李薇等[27]在云南省德宏州隴川縣拉影鎮與芒市遮放鎮兒童腸道寄生蟲感染調查和楊毅梅[28]等關于云南省農村人群腸道蠕蟲感染現狀調查發現蛔蟲感染率分別為12.06%﹑19.88%，占據比較大的比例。在野生動物寄生蟲感染的文獻查閱中發現，蛔蟲感染強度通常居于第二[19-20]。蛔蟲主要寄生在動物的小腸內，大量或慢性的感染蛔蟲會引起宿主營養不良、腹痛、腹瀉和消瘦等不良癥狀，嚴重時會造成腸梗阻導致死亡。家養畜禽和野生動物感染蛔蟲率較高，引起蛔蟲病的發生，從而造成巨大的經濟損失，其中，野生動物腸道內最常見的寄生蟲主要有犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)[21]、獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)[29]、馬副蛔蟲(Parascarisequorum)和豬蛔蟲(Ascarissuillae)等蛔蟲。

池鷺是一種遷徙鳥，途經地區較多且活動范圍較廣泛，因此極易感染蛔蟲病。另外，池鷺是一種觀賞性動物，在動物園里活動時游客有時會對它投喂食物，從而可能使人感染蛔蟲病。池鷺屬于國家Ⅱ級保護動物，此次收集到的樣品為野外的野生動物，可以為我們做好野生動物的預防保護工作提供依據。

4 結 論

本例池鷺死亡是由弓首科蛔蟲和福氏志賀桿菌混合感染引起，該株福氏志賀桿菌與江蘇分離株EU409294.1屬于同一分支，與墨西哥分離株LC318444.1親緣關系較近。