16S rRNA測序法檢測倉鼠頰囊內(nèi)細菌種類的研究

陳璟恒 張芙蕊 李和平

(東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040)

16S rRNA分子是研究細菌群落最佳靶分子，利用保守區(qū)序列設計通用引物來進行PCR擴增，利用可變區(qū)序列來進行種屬分類[1]。目前，16S rRNA 測序是研究腸道微生物的重要方法之一，該方法可以對腸道微生物中的所有菌種進行精確定量，因此正逐漸成為研究腸道微生物菌種豐度變化的主流[2]。

動物的頰囊，又稱食囊，是靈長目(Primates)的獼猴(Macaca)和嚙齒目(Rodentia)的松鼠(Sciuridae)、蒙古黃鼠(Spermophilusdauricus)、倉鼠(Cricetidae)等動物的口腔內(nèi)兩側的一種特殊的囊狀結構。靈長目動物的頰囊主要用于貯藏食物[3]，單孔目(Monotremata)動物鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)的頰囊作用特殊，用于收集細小的砂石，幫助其磨碎幾丁質(zhì)或者其他堅硬的食物[4]。倉鼠的頰囊除儲存作用之外，還充當氣囊，當倉鼠落水時，便會在頰囊中充氣，形成氣囊，能夠讓其把頭露出來游泳[5]。動物的消化道中棲居著大量微生物，它們參與飼料的分解和轉化作用[6]。在倉鼠頰囊中，其微生物(細菌菌落)棲居情況尚不清楚，因此，為了探明其微生物種類，本研究利用16S rRNA 測序技術，通過分析倉鼠頰囊微生物菌種豐度變化，來確定倉鼠頰囊內(nèi)細菌種類，為倉鼠頰囊內(nèi)食物的消化生理作用提供基礎的科學參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

購自哈爾濱市大發(fā)市場實驗用倉鼠5只。

1.2 試驗方法

1.2.1 頰囊液體提取

將倉鼠進行口腔局部解剖，剝離出倉鼠的頰囊，并保證頰囊不破裂，用BIORISE公司的OC-100 DNA樣本采集袋(含口腔拭子)插入倉鼠頰囊，并進行擦拭，待口腔拭子沾滿頰囊內(nèi)液時，迅速將口腔拭子插入裝有1 mL唾液保存液的唾液DNA收集器中。

1.2.2 16S rRNA提取及物種分析

將被倉鼠頰囊內(nèi)液體浸濕的口腔拭子插入上海朗賦生物科技有限公司生產(chǎn)的SAL2000L唾液樣本采集管中，讓拭子充分浸入唾液保存液中，立刻放入液氮罐中速凍后，送往深圳市華大基因有限公司測序。

2 結果與分析

對粘有倉鼠頰囊液體的口腔拭子進行細菌的16S rRNA測序，并對細菌種類進行注釋分析。測序結果如表1所示，放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)占到了所鑒定菌群的三分之二，是最具有優(yōu)勢的菌門。γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和放線菌綱(Actinobacteria)在所鑒定的菌群中占比也超過三分之二，是最具優(yōu)勢的菌綱。在細菌目水平，棒狀菌目(Corynebacteria)和乳桿菌目(Lactobacillales)以及丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)是最高頻菌目，其他菌目比例較低。在細菌科水平，最具優(yōu)勢的菌科分別為棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)、產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)。德克斯氏菌屬(Derxia)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)是現(xiàn)已知分類的最具優(yōu)勢的菌屬。

表1 倉鼠頰囊內(nèi)細菌種類及其豐度

Tab.1 The sorts and abundances of bacteria from hamster’s cheek pouches

3 討論

倉鼠的主要食物為蔬菜類、谷物類、種子類、蛋白質(zhì)類，以谷物和少許豆類為主[7]。從頰囊的物理性質(zhì)以及倉鼠的食性判斷，頰囊并不具備通過扭轉等作用，將食物擠壓、磨碎的功能，倉鼠也不會像鴨嘴獸一樣在頰囊中儲存細小的砂石，通過砂石磨碎幾丁質(zhì)與堅硬的農(nóng)作物外殼[4]。

通過對倉鼠頰囊內(nèi)液體進行的16S rRNA細菌菌群分布結果可以看出，倉鼠的頰囊中含有擬桿菌屬(Bacteroides)、色桿菌屬(Chromobacterium)、乳桿菌、德克斯氏菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)等。其中乳桿菌包括了雙歧乳桿菌種(Lactobacillus_animalis)、倉鼠乳桿菌種(Lactobacillus_hamsteri)、口腔乳桿菌種(Lactobacillus_oris)，乳桿菌具有分解糖類底物，產(chǎn)生各種功能性酶的作用[8]，因此這3種乳桿菌均對食物具有一定的消化作用。

乳桿菌在腸道中可有利于恢復腸道正常微生物群體的生態(tài)平衡，促進消化和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[9]。腸道中的雙歧桿菌則可以調(diào)整菌群[8]，并分泌多種酶促進鐵、鈣和維生素的吸收，某些產(chǎn)物還能改善蛋白質(zhì)的代謝[10]。由于倉鼠將食物放在頰囊中的時間和頰囊中微生物含量是有局限性的[11]，因此可推斷，倉鼠頰囊對食物并沒有直接的消化作用或消化作用不明顯，但食物在頰囊這個非干燥條件下的貯存，可以對食物之后的咀嚼與消化起到促進作用。