Krüppel樣轉錄因子2的表達調控

荊堂堂，胡俊秀，倪晉澤，穆靖洲，趙玉菲，朱 亮※

(1.大連醫科大學基礎醫學院 a.生理教研室，b.中西醫結合基礎教研室，遼寧 大連 116044；2.復旦大學附屬華山醫院胸外科，上海 200040)

內皮可在循環血液與血管壁內層及周圍組織之間形成界面。內皮的特殊位置結構導致內皮表型受到多種調控因素的影響[1-2]。層流剪切力可刺激內皮細胞產生血栓調節蛋白和內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)等保護型分子物質，對內皮抗炎、抗血栓作用起保護作用。一些有害性刺激(如血液湍流、炎癥因子、糖尿病患者體內增加的糖基化產物)均可導致內皮功能紊亂[3]。Krüppel樣轉錄因子(Krüppel-like transcription factor,KLF)2參與調節血管張力、抗炎、抗血栓以及血管形成/血管新生等重要過程，對維持血管穩態至關重要[4]。闡明KL2的表達調控機制有助于臨床器官保存以及心血管疾病的治療。現對KLF2的表達調控機制予以綜述。

1 概 述

1.1KLFs的特點 KLFs的特征與其他鋅指蛋白類轉錄因子不同。KLFs的C端鋅指結構為3個連續的Cys2/His2結構(兩個半胱氨酸和兩個組氨酸殘基)分別螯合一個Zn2+組成，各鋅指結構之間依靠7個氨基酸組成的空間序列 TGEKP(Y/F)X連接，其鋅指結構可與DNA分子上的GT盒或CACCC序列結合發揮作用(圖1)[5]。與DNA結合域的高度同源性不同，KLFs的非DNA結合域結構的同源性較少，其N端有共同的保守序列，稱為轉錄激活/抑制區，KLFs各成員主要通過識別各自不同的轉錄激活區和轉錄抑制區，發揮不同的調控作用[6]。

Activation/Repression Domain：激活/抑制區；TGERP：7個氨基酸組成的空間序列

圖1 KLF家族結構示意圖

1.2KLF2的基本特性 自1993年發現EKLF/KLF1以來，共有17種KLF蛋白相繼被發現，根據發現的先后順序依次命名為KLF1～17，此外，根據各因子最早發現的組織或器官部位的不同，又分別有特殊的命名。KLF2編碼區包括轉錄激活區和轉錄抑制區，共編碼354個氨基酸，泛素連接酶1可與相應的轉錄抑制區結合，使KLF2發生降解和泛素化[7]。KLF2的表達在機體發育過程中不斷變化，小鼠胚胎發育第7天，可以檢測到KLF2的表達；第11天時，KLF2表達下降，而第15天時又迅速上升。

轉錄因子KLF2通過調節內皮生物活性發揮調節血管張力、抗炎、抗血栓、抗動脈粥樣硬化等重要作用。有針對性的缺失位點分析顯示，KLF2對調控T細胞成熟和維持T細胞靜息狀態至關重要，可在胸腺細胞和T細胞的增殖分化過程中發揮關鍵作用，是正常肺發育所必需的因子[8]。Zhong等[8]對KLF2基因敲除單側腎切除小鼠模型的研究發現，模型小鼠腎小球濾過率降低、下游基因eNOS表達減少，且腎KLF2表達的減少與腎臟疾病發展相關。Liu等[9]對肝移植模型的研究發現，冷保存肝臟中KLF2及下游血管保護性因子的表達下調。

1.3應力轉導和KLF2表達 應力轉導指將細胞受到的摩擦力、壓力、牽引力、重力和剪切力等刺激的機械能轉化為電信號或生物化學信號，并最終引起細胞生理反應的過程[10]。目前，關于應力轉導的具體機制尚未完全明確，但應力轉導組件多定位于胞膜或胞質，激活細胞的多種級聯信號反應，即最終的細胞反應是基于作用于細胞表面的機械刺激而發生。機械力通過細胞-細胞和細胞-基質連接組成的多蛋白復合-微管骨架的三維變化作用于內皮細胞表面，并將機械信號進一步轉導到細胞[11]。

內皮細胞應力轉導過程可分為兩個階段：第一階段為纖毛彎曲引起細胞內鈣的增加和一氧化氮、內皮素等血管活性物質的釋放；第二階段為細胞骨架的改變，首先引起KLF2等基因表達的改變，然后調節內皮細胞適應動態機械力的變化。KLF2是首個被報道的可受流體調控的內皮細胞轉錄因子[11-12]。Dekker等[12]發現，與靜置培養相比，人臍靜脈內皮細胞置于層流血流剪切力24 h(2.5 N/m2)后，KLF2基因的表達量增加5倍。

2 KLF2的表達調控機制

人類KLF2定位于染色體的10p13.1，與小鼠KLF2基因的同源性大于85%[13]。位點分析顯示，KLF2轉錄起始點上游含有一段長約75 bp的高度保守序列，包含肌細胞增強因子2(myocyte enhancing factor 2，MEF2)的結合部位[14]。當血流正常時，MEF2可在剪切力的作用下與KLF2啟動子上MEF2的結合位點結合，激活KLF2表達通路，使KLF2信使RNA(messenger RNA，mRNA)和蛋白水平的表達增加[15]。血流剪切力不僅可在轉錄水平激活KLF2啟動子誘導KLF2表達，還可使KLF2 mRNA水平保持穩定[16]。MEF2與KLF2相應位點的結合受血流影響不大，但MEF2的轉錄激活受其上游胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)5的調節，此外，促分裂原活化的蛋白激酶激酶5(mitogen-activated protein kinase kinase 5，MEK5)可上調ERK5[17]。另有研究發現，促AMP活化的蛋白激酶可激活MEF2，由于促AMP活化的蛋白激酶處于MEK5/ERK5/MEF2的上游，故其活化對剪切應力誘導的ERK5和MEF2磷酸化至關重要，見圖2[18]。

3 調控KLF2表達的因素

由于血管內皮處在循環血液與血管壁之間的特殊位置結構，內皮表型除受到上述主要血流剪切力的生物力學影響外，還受一些體內內源性物質和化學藥物的影響，如他汀類藥物、白藜蘆醇、多巴胺、雷帕霉素等刺激性因素和炎癥因子、高血糖等抑制因素[1-2]。利用KLF2的某一調控因素可間接增加或減少KLF2的表達，從而達到治療疾病的目的，為臨床疾病治療提供新的方案。

3.1調控KLF2表達的刺激因素

3.1.1組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)5 在靜態或血流中斷條件下，HDAC5可與KLF2啟動子上的MEF2結合，抑制MEF2的轉錄活性。當血流剪切力(12 dyne/cm2)存在時，可通過激活鈣離子/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶信號通路，使HDAC5發生磷酸化，HDAC5的細胞定位由細胞核到細胞質，解除對KLF2的抑制，促使KLF2轉錄[19]，見圖2。湍流剪切應力促進 Ⅰ 類和 Ⅱ 類HDAC(HDAC3、HDAC5、HDAC7)的表達，通過磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B信號通路與MEF2結合，使KLF2表達下調，而層流切應力誘導磷酸化依賴的Ⅱ類HDAC(HDAC5、HDAC7)出核，誘導KLF2的表達[20]。

3.1.2硫氧還蛋白互作蛋白 在層流剪切力作用下，內皮硫氧還蛋白互作蛋白的表達下調，硫氧還蛋白活性增加，從而誘導KLF2的表達，抑制炎癥反應[21]。相反，血流中斷時，硫氧還蛋白互作蛋白的表達上調，通過促進白細胞黏附和降低KLF2表達促進炎癥反應。Wang等[22]通過熒光素酶和染色質免疫沉淀實驗發現，硫氧還蛋白互作蛋白可與KLF2啟動子的-157～-78 bp區域結合，形成轉錄抑制復合物的一部分，抑制KLF2表達。

3.1.3他汀類藥物 他汀類藥物是臨床廣泛應用的降脂藥物，一些他汀類藥物可以劑量依賴方式誘導 KLF2表達[23]。他汀類藥物誘導KLF2表達的機制為：他汀類藥物通過抑制RhoA蛋白的關鍵基團——牛兒基焦磷酸基團的補充解除RhoA蛋白對MEK5/ERK5/MEF2通路的抑制效應，誘導KLF2的表達，見圖2。有證據表明，臨床上可通過上調KLF2達到他汀類藥物的治療效果，可在冷保存液中添加辛伐他汀，以維持移植肝臟等移植物中KLF2表達，減少內皮細胞的損傷[8]。

KLF2：Krüppel樣轉錄因子2；Mechanosensory complex：機械感受器復合體；Inhibited PI3K pathway：抑制磷脂酰肌醇-3-激酶通路；upregulated：上調；AMPK：AMP活化的蛋白激酶；MEK5：促分裂原活化的蛋白激酶激酶5；ERK5：胞外信號調節激酶5；Nucleolin：核仁素；hnRAP-D：異質核蛋白D；PCAF：P300/CBP相關因子；MEF2：肌細胞增強因子2；KLF2 activation of expression：促進KLF2表達；KLF2 mRNA stability：穩定KLF2的信使RNA；ATG：起始密碼；Resveratrol：白藜蘆醇；SIRT1：乙酰化酶1；Dopamine：多巴胺；D2：多巴胺受體；statins：他汀類藥物；HMG-CoA：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；Mevalonate：甲羥戊酸；GGPP：牛兒基焦磷酸基團；RhoA：Ras同源基因家族成員；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1：白細胞介素-1；Cytokine receptor：細胞因子受體；NF-κB：核因子κB(由p50和p65基團組成的核因子)；p65：核因子NF-κB的組成基團；TXNIP：硫氧還蛋白互作蛋白；HDAC：組蛋白去乙酰化酶；OX-LDL：氧化型低密度脂蛋白；High blood glucose：高血糖；FoxO1：叉頭框蛋白O1；miR-92a：微RNA-92a；p53：一種抑癌基因；KLF2 inhibition of expression:抑制KLF2表達；3′-UTR：3′非翻譯區；Endothelial cell：內皮細胞

圖2 KLF2的表達調控

3.1.4白藜蘆醇 白藜蘆醇是一些植物和紅酒中含有的一種多酚成分，是KLF2的有效誘導劑。Gracia-Sancho等[24]研究表明，白藜蘆醇首先激活去乙酰化酶1，然后通過去乙酰化酶1激活下游MEK5和MEF2，促使KLF2表達上調，見圖2。白藜蘆醇通過上調KLF2的表達和抑制細胞間黏附分子-1和單核細胞趨化蛋白-1的表達，抑制腫瘤壞死因子-α誘導的炎癥損傷，間接保護內皮細胞[25]。

3.1.5多巴胺 結構和功能異常的腫瘤血管缺乏交感神經支配和多巴胺調節。Chakroborty等[26]研究表明，外源性多巴胺可通過與D2受體結合糾正異常腫瘤血管形態，改善血流并降低腫瘤缺氧。多巴胺主要通過增加ERK5表達增加KLF2表達，提高腫瘤中血管生成素-1的表達，從而發揮改善腫瘤缺氧的作用，見圖2。研究表明，多巴胺可促進腫瘤血管內皮細胞中KLF2的表達，通過上調KLF2信號通路調節腫瘤血管內穩態，提高抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶的治療效果，發揮抗腫瘤作用[27]。

3.1.6雷帕霉素 雷帕霉素是從冠狀動脈支架中洗脫以減少再狹窄的藥物之一，其對內皮細胞的作用較復雜，可能通過增加內皮細胞中KLF2的表達抑制血栓形成[28]。研究認為，KLF2可能作用于PI3K/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路的下游靶點，雷帕霉素通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制PI3K/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路并利用ly2940002特異性抑制PI3K穩定KLF2的mRNA水平[29]，見圖2。

3.1.7其他因素 其他參與剪應力誘導KLF2表達的輔助因子包括p300/CBP-相關因子，核內不均一核糖核蛋白D、核仁素等。Che[30]的研究表明，p300/CBP-相關因子和核內不均一核糖核蛋白D通過與KLF2啟動子-157～-95 bp區域長約30 bp的剪切力誘導區結合形成復合物，促進PI3K依賴途徑的組蛋白H3和H4乙酰化誘導KLF2啟動子染色質重塑，促使KLF2表達。

3.2調控KLF2表達的抑制因素

3.2.1微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一類分子量為18～24 bp的具有調控功能的非編碼RNA，可結合到目標mRNA的3′非翻譯區，通過翻譯抑制或mRNA降解在轉錄后水平調節基因表達[31]。敲除HUVECs合成miRNA途徑的關鍵組件發現，KLF2表達增加，表明miRNA可在血流依賴性調節KLF2表達過程中發揮重要作用。KLF2的3′非翻譯區包含1個miR-92a的結合位點，表明層流可下調miR-92a，并誘導KLF2的表達[32]。

3.2.2炎癥因子 某些炎癥因子可抑制KLF2表達。人臍靜脈內皮細胞暴露于白細胞介素-1時，KLF2的表達明顯降低，此外，腫瘤壞死因子-α也有類似作用[33]。腫瘤壞死因子-α通過核因子κB抑制KLF2表達，但不依賴于核因子κB與KLF2啟動子的直接結合。Kumar等[14]的研究表明，核因子κB的p65亞單位與HDAC4結合后，可與KLF2啟動子結合，對MEF2介導的KLF2表達起抑制作用，見圖2。

3.2.3低密度脂蛋白 低密度脂蛋白通過DNA和組蛋白的甲基化抑制內皮KLF2表達。低密度脂蛋白下調KLF2的表達，導致內皮功能失調，使血管內皮處于高凝狀態[34]。Kumar等[35]的研究表明，低密度脂蛋白導致血管內皮處于高凝狀態的機制為低密度脂蛋白經過DNA甲基轉移酶1誘導CpG二核苷酸甲基化，甲基化CpG島使MEF2與KLF2啟動序列的結合發生障礙，促進由甲基化CpG結合蛋白2和組蛋白甲基轉移酶組成的轉錄抑制復合物的組裝，從而抑制KLF2的表達，見圖2。

3.2.4高血糖 高血糖(血漿葡萄糖≥35 mmol/L)可抑制人臍靜脈內皮細胞和糖尿病大鼠頸總動脈中KLF2和eNOS的表達，由叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，FoxO1)直接與KLF2啟動子結合介導(圖2)，可能是糖尿病患者內皮功能障礙的機制之一[36]。Lee等[37]通過染色質免疫沉淀分析實驗發現，阿托伐他汀可抑制FoxO1對KLF2和eNOS的負調控，恢復高糖培養條件下內皮細胞KLF2和eNOS的表達。可見，阿托伐他汀可使FoxO1磷酸化，磷酸化的FoxO1從細胞核轉移到細胞質，轉移到細胞質具有活性的FoxO1可完全阻止阿托伐他汀對KLF2的誘導(圖2)。

3.2.5銜接蛋白p66shc 銜接蛋白p66shc具有促進細胞氧化、細胞凋亡的作用，可導致動脈粥樣硬化。KLF2是調控eNOS和抗氧化酶表達的正性調節因子，與內皮細胞中銜接蛋白p66shc的表達呈負相關。Kumar等[38]的研究表明，銜接蛋白p66shc可下調MEF2A表達，導致KLF2和血栓調節蛋白的表達降低；敲除銜接蛋白p66shc后，KLF2和血栓調節蛋白的表達增加，且過氧化氫水平下降。

3.2.6p53 p53是一種抑癌基因，對調節細胞周期、DNA修復和凋亡等起重要作用。Kumar等[39]研究表明，p53可通過與KLF2啟動序列上對應的p53結合區(圖2)結合、動員HDAC、促進組蛋白H3乙酰化抑制KLF2的表達。KLF2在調節血管功能(包括腦屏障通透性)方面起重要作用。β淀粉樣蛋白1～42誘導的KLF2表達的減少由p53介導，阿爾茨海默病患者體內β淀粉樣蛋白1～42的表達累積可抑制KLF2的表達[40]。

4 小 結

多種調控機制對KLF2表達具有調節作用，血流依賴性轉錄因子KLF2的調控機制是臨床心血管疾病研究的重點。動脈粥樣硬化、糖尿病和腦卒中等心血管疾病中KLF2的表達降低，利用KLF2的調控機制增加KLF2表達有利于心血管疾病的治療[41]。研究KLF2表達機制與血管內皮之間的關系對探索新的心血管疾病或癌癥治療方法以及器官保存液的配置和器官保存方法的新思路具有重要意義。根據KLF2的表達機制，通過調節KLF2的表達或功能將為一系列人類疾病治療提供新的治療策略。