RPL34基因在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

劉 慧，張彬彬，王昊楠，曹 斐，吳曉霞，單永鋒，郁 皓

(無錫市第五人民醫院腫瘤科，江蘇 無錫 214000)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均位居前列[1-2]。全球每年新發胃癌約100萬例，我國占42%～48%[3-5]。目前，手術治療是可能治愈胃癌的主要手段，然而大部分胃癌患者確診時已為進展期[6]。進展期胃癌發展迅速、預后極差，治療選擇非常有限，傳統化療初治有效[7]，但治療時間窗有限，大部分患者在治療過程中很快相繼發生耐藥、復發及轉移，中位生存期一般不超過12個月[8-10]。

治療后耐藥、復發及侵襲轉移等是惡性腫瘤相關死亡的主要原因。隨著靶向治療的迅速發展，腫瘤的精準治療技術不斷提高，合理個體化方案的制定是未來腫瘤治療的主要發展方向。近年來，惡性腫瘤的靶向治療以及傳統化療藥物基礎上的聯合靶向治療逐漸成為研究熱點。針對不同患者群體設計個體化治療方案以及實現進展期胃癌的精準治療是提高患者生存質量、延長生存期的關鍵。隨著胃癌發生、發展和轉移過程中分子生物學和分子病理學等機制的深入研究，有關安全、有效、新型靶向藥物的研發逐漸增多，胃癌分子靶向治療的應用前景廣闊。目前，胃癌的靶向治療策略主要包括抗人表皮生長因子受體2治療[11]、抗雷帕霉素靶蛋白治療[12]、抗程序化細胞死亡受體-1[13]、表皮生長因子受體抑制劑和血管內皮生長因子受體抑制劑[14]等。近年來，注射用曲妥珠單抗(赫賽汀)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、曲妥珠單抗美坦新衍生物、阿帕替尼、依維莫司等藥物相繼應用于臨床，但大部分進展期胃癌患者的中位生存期仍未超過16個月[15]。因此，仍需進一步探索新的進展期胃癌治療手段。

核糖體蛋白L34(ribosomal proteins L34，RPL34)屬于RPL34E家族，具有合成蛋白質的功能。早期研究發現，RPL34在多種腫瘤細胞中高表達，在某些惡性腫瘤的發生、增殖、生長、侵襲與轉移過程中發揮重要作用[16-17]。研究發現，RPL34在胃癌細胞系中呈高表達，但RPL34在胃癌組織中的表達和分子作用機制及其對胃癌的影響尚不明確[18]。本研究主要探討RPL34基因在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年2月至2019年2月在無錫市第五人民醫院治療的60例胃癌患者的胃癌組織標本、配對癌旁組織(距腫瘤邊緣≥3 cm)及正常胃黏膜組織，將術后離體標本分為兩份，一份于液氮速凍，并轉入-80 ℃冰箱凍存；另一份于中性甲醛固定后制成石蠟標本，所有標本均經病理學證實。60例胃癌患者中，男39例，女21例，年齡29～81歲，中位年齡55歲；其中高分化型胃癌10例，中分化型胃癌23例，低分化型胃癌27例； 淋巴結轉移：N05例，N115例，N222例，N318例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例。所選患者術前均未行放療、化療及免疫治療。

1.2試劑來源 人胃癌細胞株SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45均購自中科院上海細胞研究所，RPMI1640培養基和胰酶蛋白(美國Gibco公司，批號：A11-102)，反轉錄試劑盒(大連Takara公司，批號：M1705)、提取總RNA所用的Trizol、TaqDNA聚合酶、引物設計合成(美國Invitrogen公司，批號：15596-026)。RPL34基因兔抗人多克隆抗體(購自美國Cell Signaling Technology 公司，批號：A0209)，免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司，Western blot試劑盒購自上海吉凱基因公司(英國Amersham公司，批號：A0217)，雙抗(一抗鼠抗，二抗羊抗鼠)購自上海新先鋒藥業有限公司。

1.3細胞培養 將人胃癌SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45細胞株置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，加入含有乙二胺四乙酸的胰酶溶液，按1∶3傳代，在5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.4實時聚合酶鏈反應法檢測不同胃癌細胞株中RPL34基因mRNA的表達 根據美國Invitrogen公司的Trizol操作抽提各組細胞株的總mRNA，按反轉錄試劑盒說明書進行操作獲取互補DNA，將得到的反轉錄產物進行聚合酶鏈反應擴增，設定程序為兩步法：經95 ℃ 15 s預變性后，再行95 ℃ 5 s變性以及60 ℃ 30 s的延火退伸，共循環45次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，以循環閾值(cycle thre-shold，Ct)值反映基因含量，通過2-ΔΔCt方法計算不同組胃癌細胞株中RPL34基因的表達情況。

1.5免疫組織化學染色及結果判定 胃癌組織、配對癌旁組織和正常胃黏膜組織蠟塊切片(4 μm)常規脫蠟水化，采用鏈菌霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法，嚴格按照試劑盒說明步驟操作，將一抗原液按1∶100稀釋，抗體設陽性和陰性對照，光鏡下觀察免疫組織化學染色切片的顯色反應，計數500個細胞中的陽性細胞數，陽性細胞未著色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、棕褐色記3分；陽性細胞面積<5%記0分、6%～25%記1分、26%～50%記2分、51%～75%記4分、>76%記4分；根據以上兩項分值的乘積得出該切片的最終得分，0～3分為陰性(-)，>3分為陽性(+)。

1.6Western blot法檢測RPL34基因表達水平 采用Western blot法檢測胃癌組織和正常胃黏膜組織中RPL34蛋白的表達情況。參照試劑盒說明書進行總蛋白抽提和蛋白濃度測定，從不同樣品中取出等量蛋白，分別將樣品蛋白濃度調為2 g/L，將蛋白上樣加入相等體積緩沖液中混勻，沸水煮浴5 min，隨后制膠進行電泳，電泳分離后轉膜，在4 ℃、300 mA恒流條件下轉膜2 h，將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上，然后進行免疫顯色，用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液室溫下封閉2 h，分別加入稀釋的一抗RPL34(1∶1 000)和GAPDH(1∶3 000)孵育2 h，TBST緩沖液洗膜3次，用封閉液稀釋相應的二抗，在室溫下進行二抗羊抗鼠IgG孵育聚偏氟乙烯膜2 h，采用試劑盒進行顯色，在暗房中獲得顯示條帶的膠片。

2 結 果

2.1不同胃癌細胞株中RPL34 mRNA的表達水平 通過2-ΔΔCt計算方法得出SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45細胞株中RPL34蛋白的相對表達水平分別為1.000±0.033、1.332±0.112、0.662±0.042和1.308±0.062，不同胃癌細胞株中RPL34 mRNA的相對表達率比較差異有統計學意義(F=61.477，P<0.001)，其中MGC80-3胃癌細胞株中RPL34 mRNA的表達最高。

2.2RPL34基因在胃癌組織中的表達情況 免疫組織化學分析顯示，RPL34在胃癌組織、配對癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達率分別為81.7%(49/60)、38.3%(23/60)和10.0%(6/60)，差異有統計學意義(χ2=63.665，P<0.001)。

2.3胃癌組織和正常胃黏膜組織中RPL34蛋白的表達情況 正常胃黏膜組織與胃癌組織中RPL34蛋白的表達存在差異，見圖1。胃癌組織中RPL34蛋白的表達水平為0.634±0.003，正常胃黏膜組織為0.166±0.001，差異有統計學意義(t=44.083，P<0.001)。

RPL34：核糖體蛋白L34；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.4RPL34基因表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、腫塊大小的RPL34基因陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)，不同腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期的RPL34基因陽性表達率比較差異有統計學意義(均P<0.01)，病理分化程度越差、合并淋巴結轉移且TNM分期越晚的胃癌患者RPL34基因陽性表達率越高，見表1。

表1 RPL34表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 (例)

RPL34：核糖體蛋白L34

3 討 論

核糖體舊稱“核糖核蛋白體”或“核蛋白體”，被認為是細胞的細胞器之一，除哺乳動物的成熟紅細胞以及植物篩管細胞外，普遍存在于其他細胞中。一般原核細胞只有一種核糖體，而真核細胞有兩種核糖體。核糖體是一種細胞內的核糖核蛋白顆粒，是蛋白質合成的重要細胞器，在快速增殖、分泌旺盛的細胞中較多，其成分由RNA和蛋白質構成，主要功能是將mRNA上的核苷酸順序按指令翻譯成蛋白質多肽鏈上的氨基酸順序，故被稱為肽鏈的裝配機，即細胞內蛋白質的分子機器。核糖體蛋白是構成核糖體的蛋白質，在真核生物細胞中已發現80種核糖體蛋白，廣泛分布于各組織[19-20]。研究表明，核糖體蛋白不僅具有合成蛋白質的功能[21]，還可能參與調控基因轉錄和翻譯、DNA修復、細胞增殖，并可維持細胞形態等核糖體以外的功能[22-23]。近年來，在胃癌、結直腸癌、胰腺癌等消化道腫瘤組織中也發現RPL34基因表達，其對腫瘤細胞的增殖、侵襲以及血管生成起促進作用，可能在腫瘤的發生、發展及預后中發揮重要作用。對腫瘤組織核糖體蛋白的深入研究，進一步闡明了腫瘤發生、發展的機制。

目前，國內外對RPL34基因與胃癌生物學特點及其臨床預后關系的研究較少，本研究通過實時聚合酶鏈反應法測定不同胃癌細胞株中RPL34基因表達情況的研究顯示，RPL34在不同胃癌細胞株中均有表達，在MGC80-3細胞株中呈高表達。體外實驗證實，RPL34在胃癌細胞系中呈高表達[16]。采用免疫組織化學法檢測胃癌組織、配對癌旁組織和正常胃黏膜組織中RPL34基因的表達顯示，胃癌組織中RPL34基因的表達明顯高于正常胃黏膜組織。采用Western blot法進行檢測進一步驗證了上述結果，提示胃癌組織中RPL34蛋白表達高于正常胃黏膜組織。本研究結果顯示，不同腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期的RPL34基因陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示RPL34蛋白高表達可能是影響胃癌患者預后的危險因素，可能參與胃癌的發生、發展、侵襲及轉移過程。

綜上所述，胃癌組織中RPL34基因的高表達可能與胃癌的發生發展密切相關。RPL34 mRNA的表達水平可能成為胃癌患者隨訪及預后評估的重要指標，并可能為制定精準胃癌靶向治療策略提供新的線索。核糖體蛋白具有結構復雜、種類繁多、功能多樣等特點，目前對RPL34基因及其與腫瘤生物學特性關系的研究較少，未來對RPL34基因的深入研究將為認識腫瘤的臨床病例特征以及腫瘤治療提供幫助。