降酸酵母結合乳酸菌對‘黑虎香’葡萄酒酸度的影響

鐘映雪，張曉芳，楊瑞群，陶芳，南立軍,2*，李雅善,2*（

1. 楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南楚雄 675000；2. 云南省高校葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，云南楚雄 675000）

黑虎香（Fox）是美洲葡萄和夏葡萄的雜交品種，果穗長，圓錐形，皮厚而多肉，青黑色，色澤鮮艷，酸甜可口，可溶性固形物含量可達17%以上，耐貯運[1]。在云南楚雄表現為粒大、有籽、糖高、酸高，多用作鮮食，只有少部分用于釀酒。

由于生態條件、品種特性及栽培方式等差異，造成葡萄原料酸度過高，釀出的葡萄酒品質不佳，所以需要降酸，來協調其口感。目前，葡萄酒降酸的主要方法有化學降酸法、物理降酸法、微生物降酸法[2]，以及與低酸葡萄汁混合來平衡酸度。以前葡萄酒生產中普遍采用物理降酸法和化學降酸法，只能作用于酒石酸而不能對生理代謝較為活躍的蘋果酸起作用，對酒的負面影響較大，而且常引起葡萄酒的瓶內發酵[3]。生物降酸法主要是利用乳酸菌將蘋果酸降解為乳酸，而導致酸降低的主要微生物是明串珠菌、乳酸桿菌、葡萄球菌和酵母菌[4-5]。有大量研究發現，釀酒酵母共有18屬70余種。其中一些酵母菌株具有降解蘋果酸的能力。新西蘭由于氣候相對冷涼，葡萄含酸量較高，廣泛采用酵母菌株Lalvin-D432和Lalvin-71B降酸[6]。本試驗采用降酸酵母和乳酸菌降低‘黑虎香’葡萄酒中的酸度，進而改進‘黑虎香’葡萄酒的口感。

目前，大多數紅葡萄酒都使用蘋果酸-乳酸發酵降酸，耗時較長；另一種途徑是利用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）降酸。在蘋果酸-酒精發酵（MAF）中將蘋果酸分解為乙醇和CO2，從而達到降酸的目的。該方法能保持酒的清爽感與口感，實現發酵和降酸同步進行[3]。

1 材料與方法

1.1 原料與輔料

1.1.1 原料

‘黑虎香’葡萄于2019年4月5日購于楚雄市東興農貿市場，顆粒飽滿、色深、皮厚、無核，可用來釀酒。

1.1.2 輔料

帝伯仕（Diboshi）降酸酵母，帝伯仕乳酸菌（FML EXPERTISE S），來自法國。安琪酵母，安琪酵母股份有限公司提供。果膠酶，來自南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與試劑

電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。UV-5500紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。PB-10酸度計。HWS26電熱恒溫水浴鍋。TG328A分析天平，上海精科儀器廠。

1.3 方法

為了在正常發酵條件下研究降酸酵母在‘黑虎香’葡萄酒中的降酸作用，每一罐樣品中加入200 mg/L安琪酵母，同時使用4組不同濃度的帝伯仕降酸酵母啟動酒精發酵，并分別命名為罐1、罐2、罐3和罐4。酒精發酵過程中每天測定還原糖、總酸、pH、可溶性固形物、色度、單寧含量，酒精發酵結束后分析降酸酵母對‘黑虎香’葡萄酒的降酸效果及對上述基本指標的影響，結合降酸效果及各項指標含量，選擇出最佳降酸酵母用量的一組，并將本組繼續進行蘋果酸-乳酸發酵試驗。

酒精發酵結束后，將4組不同濃度（0、5 mg/L、10 mg/L和15 mg/L）的帝伯仕乳酸菌添加進上述選出的‘黑虎香’葡萄酒中，啟動蘋果酸-乳酸發酵，每隔5 d測一次總酸、色度、pH，研究乳酸菌對‘黑虎香’葡萄酒的降酸效果及對pH、色度的影響，選出最佳乳酸菌添加量。

1.3.1 基本指標的測定方法

糖、酸和揮發酸依據GB/T 15038—2006總糖、總酸和揮發酸的測定方法[7]；密度瓶法測酒度[8]；分光光度計法測色度[9]；高錳酸鉀滴定法測單寧[10]；pH示差法測花色苷[11]；折光儀法測可溶性固形物[12]。

1.3.2 工藝流程關鍵控制點用恒溫水浴鍋將溫度控制在20～22 ℃。為了防止發酵過快，導致降酸酵母作用效果不明顯的現象發生，將溫度盡量控制的較低。

1.4 統計分析

采用SPSS和Excel 2003進行數據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 原料基本指標值

原料各項基本指標含量如表1。此批‘黑虎香’葡萄原料糖度較低而總酸較高，用來研究微生物降酸效果可極大的提高試驗顯著性，原料衛生標準良好，pH正常，花色苷、色度、單寧和可溶性固形物含量均較好。

表1 原料基本指標數值Table 1 Value of basic indicators of raw materials

2.2 酒精發酵期間溫度和比重的變化

2.2.1 罐1

4月5日，原料入罐。第2天下午開始發酵，葡萄醪上浮并伴有大量起泡產生，果香濃郁。第3天，進入發酵旺盛期，能略微聞到酒香，但果香占主導，底部出現白色酒石沉淀。第4天，酒香越發濃郁，果香略微減弱，白色酒石沉淀增多。至第6天，發酵開始減弱，底部白色酒石以及其他沉淀增多。至第7天，發酵幾近終止。之后，開始皮渣分離。

罐1使用的是200 mg/L安琪酵母（不加降酸酵母），其發酵特性是對酒精發酵的啟動最慢，直至4月6日下午，酒精發酵速度才加速，一直持續到4月9日，開始減慢，直至發酵終止。發酵期間溫度起著重要作用，4月5～6日溫度快速上升，之后下降；4月8日降到最低點，然后又快速上升；4月10日上升到最高，然后緩慢下降；到4月12日又開始上升。整個發酵期間，溫度變化范圍始終保持在20～22 ℃（圖1）。

圖1 罐1的發酵曲線Figure 1 Fermentation curve of tank 1

2.2.2 罐2

4月5日，原料入罐。第2天，有少許小氣泡產生，果香濃郁，溫度上升。4月7～8日，發酵旺盛，葡萄醪上浮，伴有大量氣泡產生，酒香出現，但果香占主導，比重明顯降低，底部出現白色酒石沉淀。之后，發酵減弱，酒香濃郁，底部白色酒石及其它沉淀增多，比重降低緩慢至趨于平緩。4月12日，酒精發酵基本結束，氣泡微弱，葡萄醪香氣幾近散失，比重維持不變。皮渣分離。

如圖2所示，酒精發酵啟動后，發酵基質溫度明顯上升。之后通過水浴鍋恒溫控制溫度，才使溫度逐漸趨于平衡，酒精發酵平穩進行；葡萄汁比重開始下降，其下降速度先慢后快再變慢，4月6日開始快速下降，4月8日減慢，4月9日發酵速度幾乎停滯，反映出酒精發酵速度趨勢。與此同時，溫度在4月6日上升到最高，然后下降，在4月8日降到最低點，又逐漸上升至最高，保持3 d，進行輕微的波動。

圖2 罐2的發酵曲線Figure 2 Fermentation curve of tank 2

2.2.3 罐3

4月5日，原料入罐。第2天，開始發酵，葡萄醪上浮并伴有少量氣泡產生，果香濃郁。第3天，發酵旺盛，略微聞到酒香，但果香占主導，底部出現白色酒石沉淀。第4天，酒香突出，果香開始減弱，白色酒石沉淀增多。至4月11日，發酵減弱，酒香濃郁，皮渣上浮十分緩慢。4月12日，酒精發酵結束，氣泡微弱。皮渣分離。

如圖3所示，4月5日原料入罐后，從6日開始比重下降速度增快（比2號罐快）；至4月7日，發酵速度開始減慢，4月9日發酵速度極慢，并于4月11日后趨于平緩，下降速度很快趨近于0。溫度的波動趨勢與圖2相似。

2.2.4 罐4

4月5日，原料入罐。第2天發酵啟動，葡萄醪上浮并伴有少量起泡產生，果香濃郁。

第4天，發酵進入旺盛期，酒香逐漸濃郁，果香略微減弱，白色酒石沉淀增多。至4月10日，發酵開始減弱，酒香濃郁，底部白色酒石及其它沉淀增多。在4月12日時，氣泡微弱，葡萄醪香氣幾近散失。之后開始皮渣分離。

在4個處理罐中，罐4最先啟動酒精發酵。因此，在發酵前期，發酵速度極快，4月6～8日為快速發酵期，之后迅速減慢，4月10日發酵速度幾乎為0，逐漸趨于平緩；當比重不再發生變化時，開始皮渣分離（圖4）。總體上，罐4溫度的變化趨勢與上述幾罐相似，不同的是罐4的發酵溫度在4月9日是所有處理中最高的，達到了23 ℃。但到發酵后期，發酵基質溫度降低，此時無需再頻繁降溫。

圖3 罐3的發酵曲線Figure 3 Fermentation curve of tank 3

圖4 罐4的發酵曲線Figure 4 Fermentation curve of tank 4

2.3 酒精發酵期間基本指標的變化

2.3.1 罐1

罐1前期啟動發酵最慢。如表2至表5所示，罐1酸度最高。‘黑虎香’葡萄酒中總酸在酒精發酵第3天達到最大值，此后則緩緩降低，而還原糖前3天下降速度較慢，之后開始快速下降，相應可溶性固形物下降也較為規律，色度先升高后降低，但是在4組對比試驗中，罐1色度保留最完整，單寧含量先降低后升高再降低，后趨于平衡，最終罐1和罐2單寧含量最高。pH值在發酵過程中較為穩定。

2.3.2 罐2

罐2酒精發酵期間基本指標的變化情況如表3所示，在發酵過程中，添加150 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的總酸呈先升高后降低的趨勢。酒精發酵第4天，酸度開始逐漸降低，發酵第7天下降速度趨于0。因此，酵母的降酸效果較為明顯。從表3中可看出，‘黑虎香’葡萄酒前期發酵速度較快，還原糖下降極快，但是發酵過程中pH較為穩定，可溶性固形物含量逐漸降低，總酸、色度不斷上升，并在發酵第3天達到最大值，而后呈下降趨勢。單寧含量先降低，而后在第3天達到最大值，此后則不斷下降，直至發酵后期趨于平衡。

2.3.3 罐3

罐3酒精發酵期間基本指標的變化情況如表4所示，添加200 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的總酸，在發酵第3天達到最大值10.78 g/L，此后酸度開始下降，且下降效果明顯。發酵過程中，還原糖、可溶性固形物逐漸降低，并且都是前期下降效果明顯，后期趨于平緩，pH值在4組對比試驗中最為穩定，色度、單寧呈先上升后下降的趨勢，并在發酵后期趨于穩定。花色素苷、單寧含量越高，葡萄酒顏色越深，色度值也越高。

2.3.4 罐4

罐4酒精發酵期間基本指標的變化情況如表5所示，酒精發酵過程中，色度與總酸在第3天達到最大值，此時葡萄酒的顏色最深。此后開始下降。總酸在第4天下降幅度最大，后期下降較為平緩。還原糖和可溶性固形物前4天下降速度非常迅速，分別降低到了8.00 g/L和8.4%，之后逐漸降低，而pH在整個試驗期間較為穩定。單寧含量在入罐第2天下降，第3天則上升，第4天達到最大值，之后則緩緩下降，發酵后期則趨于平衡。

2.4 酒精發酵結束后基本指標的變化

酒精發酵結束后，殘糖含量最低的是罐2，為3 g/L；總酸含量最低的是罐2和罐3，為7.69 g/L；酒精度最高的是罐3，為7.78% vol；花色苷濃度最高的是罐3，為263.3 g/L；可溶性固形物含量最高的為罐1和罐3，均為6.4%；單寧含量最高為罐1和罐2，為0.75 g/L，罐3的單寧含量為0.58 g/L；色度值最大的是罐1，為25.16，其次是罐2，為24.3；揮發酸均保持在較低水平；pH值均在正常范圍，故選用200 mg/L降酸酵母發酵而成的葡萄酒（罐3）進行接下來的乳酸菌降酸試驗。

2.5 蘋果酸-乳酸發酵期間基本指標的變化

2.5.1 pH

采用上述200 mg/L降酸酵母發酵而成的葡萄酒加入帝伯仕乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發酵。圖5所示，蘋果酸-乳酸發酵期間4組的pH值均穩定在3.28～3.42。其中，添加了10 mg/L乳酸菌的一組比其它3組更穩定，即添加了10 mg/L乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發酵的‘黑虎香’葡萄酒穩定性優于添加了5 mg/L和15 mg/L的兩組，也優于不添加乳酸菌的對照組。添加5 mg/L乳酸菌的酒樣變化最明顯，變化幅度最大，最不穩定。

表2 罐1酒精發酵期間基本指標的變化Table 2 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 1

表3 罐2酒精發酵期間基本指標的變化Table 3 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 2

表4 罐3酒精發酵期間基本指標的變化Table 4 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 3

表5 罐4酒精發酵期間基本指標的變化Table 5 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 4

2.5.2 總酸

蘋果酸-乳酸發酵期間總酸的變化情況如表6所示，不添加乳酸菌的處理酸度值發生了略微變化，而進行蘋-乳發酵的其他3個處理，酸度發生了較大變化。表6顯示，5 mg/L乳酸菌處理30 d后酸度降低0.34 g/L，10 mg/L乳酸菌處理30 d后酸度降低0.83 g/L，15 mg/L乳酸菌處理30 d后酸度降低0.68 g/L。綜上所述，乳酸菌降酸效果最好的為添加10 mg/L乳酸菌處理。

2.5.3 色度

如表7所示，至發酵第30天，不添加乳酸菌的處理色度最高，為9.94，但是下降幅度最小；3個處理依次為10 mg/L、5 mg/L、15 mg/L，至發酵第30天，分別降低至8.68、8.20和7.21，下降幅度由快至慢依次為添加15 mg/L、5 mg/L、10 mg/L處理。進行蘋果酸-乳酸發酵的其他3個處理中，色度最低的為添加了15 mg/L乳酸菌，最高的為添加了10 mg/L乳酸菌，葡萄酒進行蘋果酸乳酸發酵可以穩定葡萄酒，因此，總體上添加10 mg/L乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發酵是最佳的選擇，不但色度保留效果最好，而且葡萄酒穩定性也是最好的。

圖5 蘋果酸-乳酸發酵期間pH的變化Figure 5 Changes in pH during malolactic fermentation

表6 蘋果酸-乳酸發酵期間總酸的變化Table 6 The change of total acid during malolactic fermentation

表7 蘋果酸-乳酸發酵期間色度的變化Table 7 Chromaticity change during malolactic fermentation

3 討論與結論

4月6日，罐1酒精發酵才緩緩啟動，但啟動發酵后發酵速度加快（圖1），這與安琪酵母發酵特性有關[13]。在4組對比試驗中，罐1色度保留最完整，單寧含量最高。單寧含量先降低后升高再降低，后趨于平衡。pH在發酵過程中較為穩定，表明葡萄酒較穩定[14]。

酒精發酵啟動后，發酵基質溫度明顯上升（圖2），主要是酒精發酵過程中產生大量CO2氣體和熱量[15]，升高了發酵基質的溫度。比重下降速度趨近于0時，意味著酒精發酵即將結束，這與栗甲等[16]研究結果一致。

在發酵過程中，添加150 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的總酸呈先升高后降低的趨勢（表3），是因為酒精發酵過程中產生了大量有機酸[17]，提高了酸度。發酵第4天，酸度開始逐漸降低，第7天下降速度趨于0，表明降酸酵母確實具有降酸作用，并且在酒精發酵終止后隨即終止[18]。

不添加乳酸菌進行發酵的葡萄酒酸度有略微變化，而其他酒樣的酸度均發生了較大變化（表6），證明乳酸菌在蘋果酸-乳酸發酵過程中具有一定降酸作用[19]。pH穩定性與葡萄酒穩定性有關，pH穩定性越高，葡萄酒越穩定[14]。蘋果酸-乳酸發酵期間4組樣品的pH均穩定在3.28～3.42，變化不大，因此，4組葡萄酒均較穩定。經過降酸酵母和乳酸菌發酵后，葡萄酒的穩定性得到了很大提高。

如表7所示，不添加乳酸菌的酒樣色度最高。添加乳酸菌后色度開始降低，主要因為乳酸菌能夠與SO2結合的物質，如丙酮酸、α-酮戊二酸等釋放出游離SO2，而SO2與花色苷結合，導致‘黑虎香’葡萄酒色度降低[20-21]。

降酸酵母作為釀酒酵母的一種，最大的特點是能夠在葡萄酒發酵期間起一定降酸作用[22]。本次試驗啟動酒精發酵采用的是帝伯仕降酸酵母[23]，其特點為耐酸、適應性強、發酵啟動較快、發酵溫度范圍廣（18～28 ℃）。能夠降低葡萄酒酸度，使口感更加柔和。能夠保持葡萄本身特有的香氣，在本試驗中有明顯的體現。因此，具有很大的發展前景。

利用降酸酵母將部分蘋果酸轉化成乙醇和CO2，或利用乳酸菌將部分蘋果酸轉化為乳酸，都可柔和葡萄酒中的酸，避免因加入過多化學降酸劑導致質量下降，降低葡萄酒酸度，改善葡萄酒口感[3]。采用不同量的降酸酵母與乳酸菌進行試驗，探究兩種微生物對‘黑虎香’葡萄酒降酸效果的影響，篩選出最佳的‘黑虎香’葡萄酒降酸工藝，對其它品種的葡萄酒或果酒的降酸也具有一定的參考價值。綜上所述，‘黑虎香’葡萄酒酒精發酵過程中，使用帝伯仕降酸酵母的3組酒精發酵啟動較快，使用安琪酵母的一組酒精發酵啟動較慢。啟動‘黑虎香’葡萄酒發酵的最佳降酸酵母用量為200 mg/L，發酵過程中能夠降低1.03 g/L的酸。

酒精發酵結束后，不添加乳酸菌發酵的一組樣品的酸度值變化甚微，色度保留較好。添加乳酸菌的3組樣品中，添加10 mg/L乳酸菌使總酸降低了0.83 g/L，pH變化最平穩，色度值最高，為8.68，色度保留最完整，降酸效果最好，酒的穩定性最好。