腦梗死后囊腔微環境分析

李秀明，劉罡

1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院，上海市 201801；2.復旦大學附屬華山醫院，上海市200031

腦梗死是發病率最高的腦血管疾病，也是世界范圍內引起死亡和嚴重殘疾的主要原因之一[1-2]。在眾多治療策略中，細胞替代治療讓新生的神經細胞替代腦梗死后死亡的神經細胞，十分具有臨床應用前景。自神經干細胞分離成功以來[3]，經過數十年發展，其體外培育、擴增和定向分化技術已經非常成熟，能為移植治療提供充足的供體細胞。

囊腔是腦組織缺血壞死后的終產物。腦梗死急性期大量炎性細胞和炎性因子浸潤[4-5]，這些炎性細胞和因子在慢性期會發生何種變化尚不清楚，是否適宜移植神經干細胞的存活和分化尚不能確定。此外，腦梗死除造成神經組織壞死外，也會損傷缺血區的血管結構[6-7]，導致囊腔內缺乏微血管，移植細胞可能無法獲得足夠養分。本研究觀察囊腔內液化學成分和囊腔壁血供情況，以初步探索囊腔微環境，分析其是否適宜干細胞移植，為神經干細胞移植部位選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley 大鼠20 只，2～3 月齡，體質量220～260 g，SPF 級，購買于復旦大學實驗動物部，并飼養于該中心SPF 環境中。許可證號SYXK(滬）2014-0029。室溫(22±1)℃，日光燈6:00～18:00照明模擬明暗周期。每籠飼養大鼠4～5 只，給予充足飼料及飲用水，定期專人更換墊料。

實驗中所涉及的動物操作均按照國際實驗動物倫理及福利標準施行，并嚴格遵守復旦大學實驗動物倫理規定。

1.2 動物模型的制備

采用線栓法制作大鼠永久大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。

大鼠吸入1.5%異氟烷麻醉，仰臥位固定于操作臺上，頸部剃毛備皮，安爾碘局部消毒。頸部正中縱行切口，鈍性分離左頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎左頸外動脈遠心端，同時在其近心端打一個小活結，其間斜剪一小切口，將線栓(深圳瑞沃德科技公司)沿切口插入近心端，打緊活結。斜切口剪斷頸外動脈，將線栓近心端下拉，直至與頸內動脈呈一直線，將線栓沿頸外動脈插入頸內動脈，術者感到有阻力感，約距左頸總動脈分叉處18 mm 處，停止插入。此時線栓硅膠頭位于大腦中動脈處。將頸總動脈連同線栓尾部的尼龍線一起結扎，剪斷多余部分，縫合皮膚。

1.3 神經行為學評分

大鼠麻醉蘇醒后，立即按Longa 法對大鼠進行行為學評分，以評價造模是否成功。0 分，無神經功能缺損；1 分，提鼠尾使其倒立，右側上肢不能完全向地面伸展；2分，自發行走時向右側轉圈；3分，自發行走時身體向右側傾倒；4 分，意識喪失不能自發行走；5分，死亡。

1～3分的動物用于后續實驗。

1.4 MRI

術后3 d、10 d 和21 d，大鼠前法麻醉，采用MAGNETOM Trio Tim 3.0 T 核磁共振成像儀(德國SIEMENS 公司)采集圖像，信號接收使用4 通道動物線圈。MRI檢測序列及參數如下。T1WI：TR 550 ms，TE 12 ms，層厚2.0 mm，15 層，FOV 60×60 mm，矩陣320×256，分 辨 率0.2×0.2×2.0 mm。T2WI：TR 3330 ms，TE 68 ms，層厚1.0 mm，18 層，FOV 50×50 mm，矩 陣256×256，分 辨 率0.2×0.2×1.0 mm；FLAIR：TR 2000 ms，TE 12 ms，層厚2.0 mm，15層，FOV 60×60 mm，矩陣256×256，分辨率0.2×0.2×2.0 mm。觀察梗死后空腔形成情況，獲取空腔及側腦室坐標。

1.5 囊腔內液及腦脊液抽取

術后23 d，選MRI 掃描確認囊腔形成的大鼠，前法麻醉，頭部固定于腦立體定位儀(美國DAVID KOPF 公司)上，使大鼠上切牙根部低于外耳道連線(耳間線)3 mm，保持大鼠顱頂處于水平面上。剔除顱頂毛發，消毒皮膚。切開皮膚、皮下組織和顱頂骨膜，少量3%H2O2涂布術區，充分止血并顯露前后囟。以前囟為基準點，根據MRI獲取的側腦室和囊腔中心點坐標調整立體定位儀，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑0.5 mm，暴露硬腦膜。鉆孔時滴加生理鹽水，保持暴露部位濕潤。立體定位儀移動臂將25 μl 微量進樣器緩慢插入囊腔中心，留置2 min 后緩慢抽取囊腔內液，留針5 min，退針。同法側腦室抽取腦脊液。囊腔內液和腦脊液分組別混勻，-70 ℃低溫冰箱(美國HARRISZHIZ公司)冰凍保存。

1.6 囊腔

1.6.1 大體觀察與取材

實驗動物深度麻醉處死，經心臟灌注生理鹽水200 ml，后灌注4%多聚甲醛300 ml，取腦，觀察囊腔大體解剖情況。為更好顯示腦膜血管，1 只實驗動物未經心臟灌注。大腦置4%多聚甲醛固定過夜；10%、20%、30%、30%梯度蔗糖脫水沉底；OCT 包埋劑(日本SAKURA 公司)包埋，冷凍后RM213 冰凍切片機(德國LEICA公司)切片，厚20 μm。

1.6.1 HE染色

冰凍切片流水沖洗后蘇木素(碧云天公司)染10 min，酒精性伊紅復染30 s，95%、95%、100%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察。

1.6.2 Lectin染色

冰凍切片加10%正常山羊血清(碧云天公司)室溫孵育2 h；異硫氰酸熒光素-葡聚糖(美國SIGMA 公司)標記的兔抗Lectin 一抗(美國SIGMA 公司，1∶1000)4 ℃孵育48 h；TBS 緩沖溶液漂洗3 次，每次10 min，封片。隨機選取腦梗死周邊區及梗死對側大腦相對區域各3 個高倍鏡視野，采集圖像并觀察囊腔形態及周邊組織構造。

1.7 質譜檢測

對混勻的腦脊液和復融后的囊腔液分別進行質譜檢測及數據分析。Bradford 法測定蛋白濃度，12%SDS-PAGE 電泳銀染。各樣品中加入適量4% SDS、50 mmol/L Tris.HCl(pH=7.5)充分混勻，加入DTT 使終濃度為100 mmol/L，95 ℃加熱5 min。冷卻后加UA 緩沖液200 μl，轉入30 K filter 中，12 000 r/min 離心15 min；再加UA 緩沖液200 μl，12 000 r/min 離心15 min。加50 mmol/L IAA溶液100 μl，室溫避光放置20 min，12 000 r/min 離 心15 min。加50 mmol/L NH4HCO3100 μl，12 000 r/min 離心15 min，重復2次。加Trypsin 50 μl 37 ℃酶解過夜。加50 mmol/L NH4HCO3溶液50 μl，12 000 r/min 離心15 min。收集管中酶解產物，冷凍干燥，0.1%甲酸水復溶。取樣品2 μg行液質聯用Obitrap檢測。

取酶解產物20 μl，加0.1%甲酸水400 μl 和SCX 6.0 μl，充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清于干凈EP 管中，標記為ft；加入pH4 緩沖400 μl 充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清置干凈EP 管中，標記為pH4；加pH6 緩沖400 μl 充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清置干凈EP 管中，標記為pH6；最后加入25%氨水、50%乙腈溶液400 μl充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清置EP 管中，標記為pH10。不同組分收集液冷凍干燥后，0.1%甲酸水充分溶解。

將各分級組分轉入進樣瓶中，取適量液質聯用檢測。各分級洗脫梯度2 h，色譜柱為C18 3 μm，120 A，75 μm ID，長150 mm。QExactive 質譜 檢測，MaxQant進行數據分析。

將囊腔液與腦脊液質譜分析結果進行對比，篩選差異分子。篩選標準為分子濃度比＞2.0 或＜0.5，倍數變化最高前10種分子為顯著差異分子。篩選出的差異分子GeneCard檢索，分析其主要功能。

2 結果

2.1 腦梗死后囊腔形成

術后3 d，MRI 示壞死區組織腫脹，信號不均勻；10 d 壞死區囊腔形成，囊腔內有T1低信號、T2高信號液體信號；21 d壞死區囊腔形態基本穩定。見圖1。

2.2 囊腔大體解剖

囊腔由壞死區周邊正常腦組織與軟腦膜共同構成，軟腦膜完整，表面存在血管。見圖2。

2.3 HE染色

囊腔中心無細胞結構；部分囊腔壁由軟腦膜構成，腦膜結構完整，其上可見腦膜血管；囊腔中心與腦膜交界處可見大量細胞聚集。見圖3。

2.4 Lactin染色

囊腔周圍可見血管分布，與對側相應腦區相比，未見明顯差異。見圖4。

2.5 差異分子

圖1 腦梗死后囊腔形成

圖2 囊腔大體解剖

圖3 囊腔周邊HE染色

圖4 囊腔周邊Lactin染色

共篩選出36種差異分子，其中31種上升，5種下降。相對濃度變化最大的10 種分子見圖5。經檢索，其中6 種顯著差異分子對干細胞移植具有正面促進作用，如抗炎、抗腫瘤、促進神經細胞存活等。NCAN(神經黏蛋白)是由神經元分泌的特異性蛋白質，廣泛分布于神經系統，可與神經元細胞膜上特異性受體神經黏附分子和膠質細胞黏附分子結合，調節細胞連接，影響軸突生長；在中樞神經系統損傷后其表達增加，并抑制軸突生長。BCAN(短蛋白聚糖)為神經細胞外基質分子，在膠質增生過程中表達增高。PLA2G7(血小板活化因子乙酰水解酶)可明顯減輕血小板活化因子和氧化磷脂的炎癥介質效應，抑制氧化應激連鎖反應，對血管內皮有保護作用。SPARCL1(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白樣蛋白1)可能抑制腫瘤生成。NELL2(神經上皮生長因子樣蛋白2)可促進神經細胞存活及生長。LGALS3BP(半乳糖凝集素-3結合蛋白)可促進整合素介導的細胞黏附，可能刺激抗病毒及腫瘤防御。

未發現能促進神經干細胞向神經元分化的相關分子，而促進向膠質增生分化的相關分子較多，另外一些分子，如神經黏蛋白，可能阻礙神經軸突生長。囊腔微環境可能主要誘導神經干細胞向膠質方向分化。

圖5 囊腔液/腦脊液質譜分析結果(相對分子倍數變化)

2.7 質譜分析

急性期反應信號通路分析顯示參與急性期反應的分子表達減少，急性期反應通路抑制；經典通路分析示抗炎及抗凋亡相關蛋白表達增加。囊腔內液分子重要網絡分析示，囊腔內液分子主要涉及神經系統疾病、細胞聚集與組織形成、組織發育、腫瘤和結締組織紊亂。見圖6～圖9。

3 討論

腦梗死后缺血區神經元大量死亡，組織結構破壞，可引起相應的功能障礙[8-10]；基于神經可塑性的功能代償往往并不充分，由缺血性損傷誘發的內源性神經再生也極為有限，遠不能替代缺血所致的神經元喪失[11]。因此，腦梗死后功能障礙常持續存在[1]。

神經干細胞移植可通過調控炎癥反應、神經保護及營養、增加突觸可塑性、促進內源性神經細胞再生等非細胞替代機制，減少缺血性損傷程度，促進部分神經功能恢復[12-13]。但受腦內微環境影響，由移植細胞分化而來的成熟神經元數量低[14]，無法重建壞死區組織結構。尋找腦梗死后適宜移植神經干細胞生長的微環境，對提高移植治療效果極為重要。

不同移植部位微環境特點各有不同[12]。在缺血壞死區周圍或對側腦實質內移植，移植細胞向壞死區遷移受限，且由于腦實質結構致密，存在形成假瘤的風險[15]；通過動靜脈系統移植[16-17]，細胞不易穿過血腦屏障到達梗死部位；通過腦室系統移植，移植細胞可隨腦脊液播散，或因腦脊液屏障存在，不易在壞死區大量聚集[18]。

在缺血壞死區，因急性期組織壞死產生大量炎性細胞和壞死因子，不利于細胞存活，曾被認為是移植效率較低的部位。但腦梗死發生后，受累組織依次經歷缺血水腫、炎性滲出、壞死液化等病理變化，最終會在缺血壞死區形成囊腔樣結構。囊腔形成的病理過程始于腦血流中斷后導致的能量代謝障礙，繼而引發一系列瀑式反應，最終導致細胞死亡和組織崩解[4,19-21]。同時，小膠質細胞被缺血性損傷激活，大量增殖，在損傷部位和缺血半暗帶區聚集。外周免疫細胞也可通過損傷的血腦屏障滲入梗死區，與小膠質細胞共同介導梗死后免疫反應，吞噬清除壞死組織，最終在缺血壞死區形成囊腔樣結構。這一過程可能需要數周時間。本研究顯示，腦梗死后3 周，梗死區即可形成形態穩定的囊腔，其內充滿腦脊液樣信號，提示囊腔內主要是液體成分。充裕的液體空間可為移植的神經干細胞提供類似于體外培養的液體環境，有利于細胞集落形成。

圖6 囊腔液質譜分析(急性期反應信號通路)

腦梗死急性期，小膠質細胞過度激活(M1 表型)，可通過產生活性氧、一氧化氮，分泌大量炎性因子，導致神經細胞損傷，抑制神經干細胞分化。而在囊腔形成的慢性期，小膠質細胞適度激活(M2表型)，產生抗炎細胞因子，分泌神經營養因子，如腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和膠質源性神經營養因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)等，發揮神經保護和神經營養作用，促進神經前體細胞增殖和神經母細胞遷移[5,22]。腦梗死后激活后的免疫細胞可能發揮雙向調節作用[5]。本研究顯示，腦梗死3 周后，與腦脊液相比，囊腔內液參與急性炎癥反應的蛋白表達減少，抗炎和抗凋亡相關蛋白表達增加，促進神經生長、黏附聚集和基質生成的相關蛋白表達增加，有利于移植神經干細胞存活。但應當注意，盡管囊腔內液對干細胞移植有促進作用，但可能主要誘導神經干細胞向膠質細胞分化，這可能是目前外源性成熟神經元數低下的主要原因。

圖7 囊腔液質譜分析結果(經典通路分析)

圖9 重要相關網絡2(腫瘤、神經系統疾病、結締組織紊亂)

充足的血供是移植細胞存活、增殖、分化并產生神經功能的前提。本研究顯示，囊腔周邊腦組織和軟腦膜內均存在大量血管。原因可能在于腦實質與腦膜分屬兩套供血系統，頸內動脈系統缺血導致腦實質梗死，而腦膜因其血供來源于頸外動脈系統而常常保持完整，且腦膜血管可能因腦組織缺血而發生代償性擴張[6,23-24]。此外，在腦梗死周邊區域，缺血本身可誘導新生血管生成[25-26]。腦梗死數小時后，梗死周邊膠質細胞、血管內皮細胞等即可上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VAGF)、一氧化氮合酶等促血管因子和其受體表達，促進血管內皮細胞增殖、遷移和血管新生，在梗死后數天即可在梗死灶周邊檢測到新生血管，此促血管新生作用可持續數周[27]。血管新生被認為是對腦梗死的代償性反應，有助于減少腦梗死體積，并促進腦梗死后內源性神經發生和突觸重塑，從而促進神經功能恢復。腦梗死后囊腔壁存在基本血液供應，可為貼壁的移植細胞提供養分支持。囊腔的相對封閉性可能允許對其進行外源性調控，如利用囊腔置管和液體置換調控囊腔微環境。可以進一步研究。

本研究從囊腔內液分子成分和血供兩方面評價了囊腔微環境對神經干細胞移植的可能影響，但還存在一些局限性。首先因實驗動物體型限制，抽取囊腔液體含量較少(每只大鼠25～50 μl)，沒有進行體外干細胞培養實驗，不能直接判定囊腔內環境的影響。針對囊腔內缺乏細胞支架的缺點，可考慮利用聚乳酸-羥基乙酸共聚作為支架，促進移植的干細胞修復缺損組織結構[28-29]。

綜上所述，腦梗死慢性期形成的囊腔作為一個相對封閉的液體空間，具備神經干細胞移植的基本條件，適宜移植細胞存活。但微環境中有關分子成分多促進神經干細胞向膠質細胞分化，還需要外源性手段干預，使其有利于移植細胞向神經元分化。