清開靈對小膠質細胞缺氧活化誘導的腦微血管內皮細胞Toll樣受體4、gp91phox和閉鎖小帶蛋白-1表達的影響

田超，瑪娜璐璐，袁夢晨，王麗琴，安娜，張涵萊，邢雁偉，孫逸坤，高永紅

1.北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室，北京市 100700；2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京市100053

全世界每年腦卒中發病人數約1500萬，是導致殘疾和死亡的主要原因，其中缺血性腦卒中超過85%[1-2]。缺血性腦卒中是一個復雜的病理生理過程，與細胞凋亡、細胞毒性、炎癥、活性氮和活性氧引起的氧化損傷有密切關聯，這些病理變化會引起血腦屏障破壞，損害神經功能[3-5]。

小膠質細胞是神經系統特有的免疫細胞，與神經系統多種疾病相關，在缺血性腦卒中的病變過程中也發揮重要作用[6]。腦缺血后，小膠質細胞活化，既分泌神經營養因子保護神經元，也分泌促炎因子包括活性氧，導致氧化應激性損傷[7-9]。活性氧等促炎細胞因子引發一系列炎癥級聯反應，引起腦微血管內皮細胞損傷和緊密連接破壞，導致血腦屏障功能和結構受損[10-11]。

清開靈注射液具有清熱解毒、化痰通絡和醒神開竅的作用，是以安宮牛黃丸為基礎研發而來。清開靈注射液臨床對缺血性腦卒中有明確療效，能促進神經功能恢復，改善患者預后[12-14]。本研究觀察清開靈注射液能否通過抑制小膠質細胞的活化，提高腦微血管內皮細胞的存活和功能。

1 材料與方法

1.1 材料

清開靈注射液(國藥準字Z11020269，10 ml/支)：亞寶北中大(北京)制藥有限公司。小鼠Balb/c 腦微血管內皮細胞：中日友好醫院婁晉寧教授惠贈。小鼠BV2 小膠質細胞(No.3111C0001CCC000063)：中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心。DMEM高糖培養基：GIBCO 公司。ECM 培養基：SCIENCELL 公司。優質胎牛血清：PAA 公司。青鏈霉素混合液：北京索萊寶科技有限公司。米諾環素：SIGMA公司。一氧化氮檢測試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒：上海東仁化學科技有限公司。Toll 樣受體4 (Toll-like receptor 4,TLR4)、gp91phox一 抗：SANTA公司。閉鎖小帶蛋白-1 (zonula occludens-1,ZO-1)：INVITROGEN公司。鼠抗β-actin、過氧化物酶標記羊抗兔IgG：武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

小鼠BV2細胞培養在胎牛血清和青鏈霉素混合液配制的DMEM 培養基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。生長至90%以上細胞匯合時，加0.05%胰酶消化液消化傳代。

小鼠Balb/c 細胞培養在配好的ECM 完全培養基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。生長至90%以上細胞匯合時，加0.25%胰酶消化液消化傳代。

將生長良好的BV2 細胞懸液以1×105/ml 接種于24孔培養板中。生長至80%細胞匯合時，PBS溶液洗2 次，更換無血清DMEM 培養基缺氧培養。細胞分為6 組：正常組單用無血清DMEM 培養基培養；模型組用無血清DMEM 培養基，置1.0%O2、37 ℃三氣培養箱中缺氧培養24 h，再置于37 ℃、5% CO2培養箱中復氧培養24 h；清開靈0.0625%組在無血清DMEM 培養基中加入0.0625%清開靈注射液，缺氧培養24 h 后復氧；清開靈0.125%組在無血清DMEM 培養基中加入0.125%清開靈注射液，缺氧培養24 h 后復氧；清開靈0.25%組在無血清DMEM 培養基中加入0.25%清開靈注射液，缺氧培養24 h 后復氧；米諾環素組在無血清DMEM 培養基中加入200 nmol/L 米諾環素，缺氧培養24 h 后復氧，復氧時更換無血清DMEM 培養基。復氧24 h后，小心吸出上清備用。

Balb/c 細胞正常培養48 h，生長至80%細胞匯合時，吸除96 孔培養板中的培養基，PBS 溶液清洗2次，每孔加入各組小膠質細胞上清100 μl，37 ℃、5%CO2培養箱中靜置24 h，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.2.2 CCK-8檢測

Balb/c 細 胞 每 孔加 入CCK-8 檢測 液10 μl，孵育40 min。波長450 nm 下檢測各孔上清液吸光度值(A值)。

1.2.3 一氧化氮濃度

Balb/c 細胞每孔吸取培養上清液50 μl，波長540 nm 下檢測各孔上清液吸光值，根據標準曲線計算樣品濃度。

1.2.4 Western blotting

BV2 細胞接種在6-well Insert 膜上層，正常培養48 h 至80%細胞匯合。PBS 溶液洗2 次，分組同前，膜內外加入相應藥物，正常組置37 ℃、5% CO2培養箱中培養，其他各組置1.0% O2、37 ℃三氣培養箱中缺氧培養。

6 孔板中接種Balb/c 細胞，正常培養48 h 至80%細胞匯合。小心吸除培養基，分別將缺氧培養24 h 的BV2 細胞移入六孔板中，Insert 內外加DMEM，置37 ℃、5%CO2培養箱中復氧培養24 h。

提取Balb/c 細胞總蛋白，BCA 定量后，等體積加入5×buffer，100 ℃煮沸20 min 備用。蛋白樣本電泳，電轉，5%脫脂奶粉搖床上室溫封閉1 h，加入配好TLR4 (1∶1000)、gp91phox(1∶1000)、ZO-1 (1∶1000)和β-actin(1∶3000)一抗，4 ℃過夜。TBST 溶液洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗3 次。暗室內膜上滴加發光液，避光壓片、顯影、定影、晾干待用。掃描膠片，使用Image J 計算灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白β-actin的比值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 內皮細胞活性

倒置相差顯微鏡下觀察，正常組內皮細胞約60%～80%貼壁良好，緊密連接成片，細胞體為鋪路石樣。缺氧后，細胞由貼壁變為懸浮，胞體逐漸變圓，與正常組有明顯區別(圖1)。

CCK-8 檢測模型組A 值低于正常組(P＜0.05)；清開靈0.0625%、0.125%和0.25%組及米諾環素組A 值均較模型組升高(P＜0.05)。見表1。

2.2 一氧化氮濃度

模型組一氧化氮濃度較正常組增加(P＜0.05)。清開靈0.0625%和0.125%組一氧化氮濃度較模型組下降(P＜0.05)。見表1。

表1 各組腦微血管內皮細胞活性和一氧化氮濃度比較

2.3 Western blotting

模型組TLR4 蛋白表達較正常組增加(P＜0.05)。清開靈0.25% 組TLR4 蛋白表達較模型組下降(P＜0.05)。

模型組gp91phox蛋白表達較正常組增加(P＜0.05)。清開靈0.0625%、0.125%和0.25%組及米諾環素組gp91phox蛋白表達較模型組降低(P＜0.05)。

模型組ZO-1 蛋白表達較正常組降低(P＜0.05)。清開靈0.0625%、0.125%和0.25%組及米諾環素組ZO-1蛋白表達提高(P＜0.05)。見圖2、表2。

圖1 各組腦微血管內皮細胞形態(倒置相差顯微鏡，×100)

圖2 各組內皮細胞Western blotting結果

3 討論

缺血性腦卒中后炎癥反應導致血腦屏障破壞，貫穿整個病程，引起腦水腫、神經細胞死亡，發病后抑制炎癥反應，可保護和修復血腦屏障[15-16]。腦微血管內皮細胞是血腦屏障重要組成部分，細胞間以緊密連接方式相連，形成基本骨架結構，保證血腦屏障的結構完整和功能正常[17]。小膠質細胞活化后分泌大量促炎因子，激活TLR4、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶等相關蛋白和通路，產生大量活性氧，破壞內皮細胞間緊密連接蛋白結構，造成血腦屏障結構和功能喪失，損害神經系統功能[18-20]。細胞體外培養實驗能避免混雜因素干擾，在觀察單因素對細胞模型的影響時尤為適用。我們選用小鼠小膠質細胞BV2細胞體外培養，模擬缺血再灌注損傷模型，利用清開靈注射液進行干預；然后將BV2 細胞和Balb/c 細胞共培養，觀察清開靈通過抑制小膠質細胞活化，保護血腦屏障內皮細胞的作用及其機制。

表2 各組內皮細胞TLR4、gp91phox和ZO-1蛋白表達(/β-actin)

本研究顯示，清開靈注射液能夠有效保護內皮細胞活性，進而保護血腦屏障的結構和功能。一氧化氮是一種重要的氣體效應分子和信號分子，可作為第二信使在諸多疾病的病理生理過程中發揮作用[21]。缺血時，一氧化氮能生成毒性更強的OH-和NO2-，引發酪氨酸硝基化反應，加重脂質過氧化程度，破壞緊密連接等蛋白，損傷內皮細胞和神經元細胞[22-23]。本研究顯示，0.0625%和0.125%濃度清開靈注射液可減少內皮細胞一氧化氮生成，保護內皮細胞。

TLR4 作為細胞因子白細胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)的上游受體TLRs 家族的重要成員，廣泛表達于中樞神經系統各細胞，包括小膠質細胞和血管內皮細胞，在缺血性腦卒中后激活，可引發一系列炎癥反應，包括激活NADPH 氧化酶產生活性氧，從而介導血腦屏障破壞[24-28]。本研究顯示，0.25%清開靈注射液能顯著降低內皮細胞TLR4 蛋白表達，從而減低炎癥反應，保護內皮細胞。

gp91phox是NADPH 氧化酶的主要功能亞基，gp91phox蛋白表達可以反映NADPH 氧化酶的激活情況[29-31］。本研究顯示，清開靈注射液可降低內皮細胞gp91phox蛋白表達，降低NADPH 氧化酶激活，減少活性氧產生，保護血腦屏障。

ZO-1作為胞質輔助蛋白的主要構成物質，是緊密連接復合體重要的組成部分，能夠連接內皮細胞，保持血腦屏障的結構和功能[32-33］。TLR4信號通路及其下游蛋白可導致緊密連接結構功能障礙，破壞血腦屏障[28］。本研究顯示，清開靈注射液可抑制內皮細胞ZO-1蛋白的破壞，促進緊密連接形成，保護血腦屏障功能。

綜上所述，本研究采用缺氧誘導BV2小膠質細胞活化，刺激Balb/c 內皮細胞損傷，通過對細胞活性、一氧化氮含量及TLR4、gp91phox和ZO-1 等相關蛋白的表達檢測，發現清開靈注射液可能通過抑制小膠質細胞缺氧活化，降低腦微血管內皮細胞TLR4 和gp91phox蛋白表達，提高ZO-1 蛋白表達，提高腦微血管內皮細胞的存活和功能，從而減輕小膠質細胞缺氧活化對腦微血管內皮細胞的損傷。