血清中DCLK1在非小細胞肺癌中的表達及應用價值

陳賢真,喬建甌

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 呼吸內科,上海200001)

2018年全球癌癥最新統計調查顯示,肺癌的發病率和死亡率目前均居惡性腫瘤中的第1位,比例分別為11.6%和18.4%[1],由于肺癌起病隱匿,且缺乏特異性癥狀,約65%的患者確診時已處于腫瘤的中晚期[2],5年生存率不足15%,因此對于肺癌高危人群,臨床上需要快速、無創、經濟及高靈敏度的篩查方法。CT的廣泛應用雖然有效提高了肺癌的早期診斷率,但同時也存在假陽性率高、經濟成本高以及輻射損傷的缺點,而目前用于肺癌早期診斷的臨床生物標志物敏感度及特異度又相對不高[3],因此,臨床上迫切需要尋找具有更高診斷價值的新型腫瘤標志物,以提高肺癌的早期診斷率。

雙皮質素樣激酶 1(doublecortin-likekinase 1,DCLK1)是具有兩個雙皮質素(DCX)結構域的絲氨酸/蘇氨酸激酶,最初被認為是神經元形成和遷移的關鍵調節因子,并具有微管聚合的功能[4]。目前累積的臨床證據支持DCLK1與腫瘤侵襲性相關,并在癌癥干細胞中表達,為癌細胞提供腫瘤起始能力[5],并在功能上參與多種惡性腫瘤的生長、上皮-間質轉化(epithelialmesenchymaltransition,EMT)及轉移過程[6],抑制DCLK1表達可促進腫瘤抑制性因子miRNAlet-7a和miRNA-200a表達增加,使腫瘤生長停滯[7,8],并同時抑制腫瘤EMT過程[8]。然而,目前關于DCLK1在肺癌中的研究還較少,外周血DCLK1表達含量和非小細胞肺癌患者的臨床關系尚未有相關報道,鑒于DCLK1在惡性腫瘤中表現出來的成瘤性,因此本課題通過檢測血清中DCLK1表達水平,初步探討DCLK1與肺癌的相關性,并與CEA對比,評價DCLK1在NSCLC患者中的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2018年1月至2018年6月經病理及影像學確診的95例NSCLC患者靜脈血樣本,標本獲取前患者均未接受行手術、化療及藥物治療,并排除有肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等肺部良性疾病,合并其它臟器疾病,合并自身免疫性疾病,有其它惡性腫瘤病史的患者。其中男性56例,女性39例,平均年齡(66.39±12.56)歲。肺癌的組織學分類采用2015年WHO標準[9],入組鱗癌患者39例,腺癌56例,臨床分期按照2009年IASLC公布的第七版TNM分期標準[10],共納入Ⅰ期19例,Ⅱ期16例,Ⅲ期22例,Ⅳ期38例。年齡、性別以及吸煙史差異在肺癌患者中均無統計學意義(P>0.05,見表1)。另選取同時期我院62例健康體檢者作為對照組,納入對象身體狀況良好,均證實無系統性疾病及惡性腫瘤病史,其中男性30例,女性32例,平均年齡(55.44±9.48)歲。所有受試者于入院第2天清晨空腹采集肘正中靜脈血2 ml于EDTA管內,立即送往我院中心實驗室,每管樣本經高速離心后取上層血清200 μl,在-80℃下儲存備用。本研究經我院醫學倫理委員會審核批準,所有受試人員均知情同意。

1.2 方法

采用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清樣本中DCLK1 的含量。DCLK1 ELISA試劑盒采購于武漢伊萊瑞特生物科技公司,試劑盒檢測范圍：(0.16-10)ng/ml。采用雙抗體夾心法,操作步驟嚴格按照產品說明書進行。簡要步驟如下：向已包被人DCLK1抗體的96孔板中加入100 μl標準品和待測樣品,37℃孵育90 min；棄去孔內液體,每孔加入100 μl生物素化抗體工作液,37℃孵育60 min；洗滌3次,每孔加入100 μl HRP酶結合物工作液,37℃孵育30 min；洗滌5次后加入90 μl底物溶液,37℃孵育15 min；加入50 μl終止液,立即用全自動酶標儀(美國THERMO公司)在450 nm波長下測量各孔的光密度值(OD值),最后帶入標準曲線方程中計算相應的DCLK1濃度。CEA的檢測由我院檢驗科采用電化學發光免疫分析法完成。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 非小細胞肺癌(NSCLC)患者和健康組中血清DCLK1表達情況比較

NSCLC患者血清DCLK1表達水平為(6.541±3.002)ng/ml,健康組為(2.802±1.363)ng/ml,DCLK1在非小細胞肺癌組中的表達水平明顯高于健康對照組,差異有統計學顯著意義(t=10.582,P<0.001,見圖1)。

圖1 肺癌患者和健康者血清中DCLK1表達水平

2.2 血清中DCLK1表達水平與NSCLC患者臨床病理特征的關系

通過對DCLK1與NSCLC患者臨床病理資料進行比較分析,我們發現NSCLC患者血清DCLK1水平與腫瘤的大小、病理類型、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移均密切相關,其中鱗癌、中晚期、中低分化和淋巴結轉移陽性的患者中血清DCLK1表達水平分別高于腺癌、早期、高分化和淋巴結轉移陰性的患者,兩組間差異均具有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 血清中DCLK1表達水平與NSCLC患者臨床病理特征之間的關系

2.3 DCLK1和CEA對NSCLC患者的臨床診斷價值比較

通過ROC曲線對比分析(見圖2),結果顯示DCLK1和CEA對于區分NSCLC患者和健康者的曲線下面積(areaunderthecurve,AUC)分別為0.879(95%CI,0.817?0.925,P<0.001)和0.799(95%CI,0.728-0.859,P<0.001),面積差異有統計學意義(P=0.044),DCLK1用于診斷NSCLC的最佳閾值為4.904 ng/ml。基于上述結果,我們進一步分析比較了DCLK1和CEA對于早期和中晚期NSCLC的診斷價值,結果顯示DCLK1和CEA診斷Ⅰ-Ⅱ期肺癌患者的AUC分別為0.747(95%CI,0.649-0.830,P<0.001)和0.653(95%CI,0.550-0.747,P=0.012),診斷Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者的AUC分別為0.939(95%CI,0.881-0.974,P<0.001)和0.885(95%CI,0.814-0.935,P<0.001),DCLK1對于早期和中晚期NSCLC患者的診斷效能均高于CEA,見表2。

圖2 A血清DCLK1、CEA診斷肺癌的ROC曲線;B血清DCLK1、CEA診斷Ⅰ-Ⅱ期肺癌的ROC曲線;C血清DCLK1、CEA診斷Ⅲ-Ⅳ期肺癌的ROC曲線

表2 DCLK1和CEA對于NSCLC患者不同臨床分期的診斷指標評價

2.4 肺癌患者和健康者血清DCLK1表達水平與CEA之間的相關性

通過對157例NSCLC患者和健康者血清中DCLK1與CEA表達水平進行Spearman相關性分析,結果顯示血清DCLK1與CEA表達水平之間呈線性正相關(r=0.478,P<0.001),見圖3。

圖3 血清DCLK1與CEA表達水平的相關性分析

3 討論

DCLK1氨基酸N末端與雙皮素(DCX)有65%的相同結構,C末端由與Ca2+/鈣調蛋白高度相關的絲氨酸/蘇氨酸結構域組成,過去也被稱為DCAMKL1[4]。既往認為DCLK1作為一種微管相關激酶,在神經元遷移,軸突運輸,突觸成熟和大腦發育中起重要作用。近年來有研究顯示,DCLK1表達陽性的細胞具有腫瘤干細胞特性[11,12],并在胰腺癌[13]、胃癌[14]、肝細胞癌[15]、食管癌[16]等多種癌癥中過度表達。Sureban等人在小鼠胰腺癌和結腸癌模型中,利用siRNA介導的 DCLK1 mRNA沉默效應,可使腫瘤抑制性因子miRNAlet-7a和miRNA-200a表達增加,腫瘤體積明顯縮小,并使癌基因c-MYC及KRAS的mRNA表達量降低45%[7,8]。在腎細胞癌的研究中,將腫瘤組織內注射DCLK1單克隆抗體CBT-15后,發現具有明顯的腫瘤抑制效應,同時能增加腎癌細胞對酪氨酸激酶抑制劑藥物的敏感性[17]。此外,DCLK1還能通過增加NF-κBp65蛋白表達,促進結腸癌的上皮-間質轉化(EMT)[18],腫瘤經歷EMT過程后,細胞間極性和基底膜消失,腫瘤侵襲和轉移能力隨之增強,EMT也被認為是腫瘤侵襲機制中重要的早期步驟[19],因此DCLK1可能通過上述多種機制影響腫瘤的形成和發展。

本實驗結果顯示DCLK1在NSCLC患者血清中高表達,且與腫瘤臨床分期、分化程度、腫瘤大小及淋巴結轉移密切相關。一般而言,腫瘤的低分化和淋巴結轉移陽性往往預示著其具有更強的組織侵襲性和惡性程度,不同TNM分期則與腫瘤負荷及預后相關,提示DCLK1可以為評估NSCLC的生物學行為及臨床分期提供一定的參考價值。然而本課題與周美玲[20]等人的研究結果有所不同,原因可能與DCLK1在肺癌組織和外周血中的表達水平存在差異有關。國外曾有文獻報道,約50%的肺癌患者血清中DCLK1基因啟動子存在甲基化現象,并與預后不良相關[21],因此我們推測DCLK1在肺癌中的高表達或許可間接反映這一過程。在不同病理類型的比較中,我們發現鱗癌患者血清中DCLK1水平明顯高于腺癌,這與Tao等人在肺癌組織中的研究結果相一致[22],提示不同的病理類型可能會對DCLK1表達水平產生一定的影響。

通過ROC曲線分析,我們發現在不同臨床分期的NSCLC患者診斷中,DCLK1的ROC曲線下面積及約登指數均高于CEA,并且對于早期和中晚期患者的診斷敏感度優于CEA,提示DCLK1用于肺癌診斷具有較高的臨床應用價值,并有望成為肺癌篩查和診斷的潛在新型腫瘤標志物。

綜上所述,外周血中DCLK1表達水平在NSCLC患者中存在明顯的腫瘤相關性,并且DCLK1在NSCLC診斷上具有較高的臨床應用價值,檢測外周血DCLK1水平可以為患者的病情評估及腫瘤診斷提供一定的參考價值。由于本研究的樣本量較少,今后尚需擴大臨床病例數來進一步評價DCLK1對肺癌診斷的價值,未來還可進一步設計前瞻性研究,探討外周血DCLK1表達水平與肺癌患者生存期及預后的關系。