基于新藥研發能力培養的藥理學實驗教學探索

高越穎， 劉 蕾， 任怡琳， 耿 燕

(江南大學 藥學院， 江蘇 無錫 214122)

0 引 言

制藥工程專業是培養具有新藥研究與開發的基本能力、有較扎實的制藥工程設計基礎知識、并具有一定的研究、解決制藥工程實際問題能力的人才。我校制藥工程專業作為教育部特色專業、江蘇省品牌專業，在人才培養過程中，尤其注重學生綜合能力的培養。從人才培養方案、教學大綱及教學過程都突出了制藥企業對學生的實際需要，從新藥研發實際出發強化學生開放性思維的培養。藥理學作為專業核心課程之一，在江蘇省精品課程建設理念的基礎上，形成了“基礎-綜合-開放創新”層次鮮明的開放式實驗課程體系，藥理學設計性實驗主要目的是培養學生的科學研究能力和創新能力[1-3]。

以前期課程(如藥物化學實驗)中合成的產品或學院科研團隊研究成果為研究對象，設置了藥效學評價、藥代動力學研究及毒性評價等研究方向，學生根據自己的擅長和興趣自愿組合，4或5人1組，查閱文獻、確定研究方向、設計實驗方案，老師組織學生對各組的實驗方案進行科學性及可行性的論證，每個同學都參與討論。最后，根據實驗設計的水平和實驗室實際條件進行篩選整合，形成1或2個可實施的設計性實驗。實驗結束后各小組整理實驗結果，進行匯報分享，每個同學都要按國家標準論文格式寫一篇論文。通過開展設計性實驗，不僅能培養學生的創新思維，綜合運用理論知識及新藥研發能力[4-6]，也能夠為教師科研工作中開展藥物合成或工藝的改進提供實驗依據。

1 實驗原理

藥食用真菌是世界公認的具有良好療效的藥食同源物質，靈芝發酵菌絲體粉(以下簡稱靈芝菌粉)是學院較成熟的科研成果，有抗氧化、抗毒性以及免疫調節的功效[7]，為探究其安全范圍，設計了急性毒性實驗，為促進其合理開發利用提供科學依據。

急性毒性是指動物一次或24 h內多次接受一定劑量的受試物，動物在短期內出現的毒性反應。傳統的急性毒性以動物死亡為判斷指標，與動物保護的“3R”原則嚴重沖突，而且對于毒性較低的受試物為求出LD50動物使用量大、死亡率高，故本研究應用固定劑量法，對其毒性表現進行觀察[8-10]。通過實驗學生能夠直觀觀察到不同劑量下靈芝菌粉是否存在毒性表現，還可通過血清生化指標、主要器官的病理切片驗證其毒性。

2 試劑及儀器

藥品與試劑：靈芝菌粉為靈芝發酵的菌絲體經噴霧干燥后得到的粉末。其余試劑均為國產分析純。

實驗動物：健康ICR小鼠，SPF級，40只，體重(20±2)g，由揚州大學實驗動物中心提供。飼養溫度25 ℃，相對濕度55%。

儀器：艾本德5810R離心機，德國Eppendorf 公司；科華卓越310全自動生化分析儀，上?？迫A生物工程股份有限公司；KD-BM生物組織包埋機，浙江金華市科迪儀器設備有限公司；KD-BL包埋冷凍臺，浙江金華市科迪儀器設備有限公司；YT-6C生物組織攤烤片機，湖北孝感市亞光醫用電子技術有限公司；LEICA RM2135切片機，德國LEICA 公司；Olympus BX41生物顯微攝影系統，日本Olympus公司。

3 實驗方法

3.1 實驗動物分組及給藥

小鼠隨機分成靈芝菌粉4個劑量(50、500、2 000、5 000 mg/kg)組[11]，另設對照組，每組8只，雌雄各半且分籠飼養。靈芝菌粉各組一次性灌胃(ig)給予相應藥物水溶液，給藥前禁食4 h，自由飲水，給藥體積10 mL/kg。對照組小鼠ig等體積蒸餾水。

3.2 一般狀態觀察

給藥后觀察小鼠的外觀，包括皮毛、呼吸、鼻眼、口腔有無異常分泌物等，觀察小鼠的精神狀態，大、小便等情況；各劑量組小鼠觀察不以死亡為指標，而以明顯的毒性反應為指標。詳細觀察給藥后4 h內小鼠反應情況，然后每天上午、下午各觀察一次，連續觀察14天[12-13]。

3.3 指標測定

小鼠給藥后14天后頸椎脫臼法處死小鼠，摘眼球取血，進行大體解剖肉眼觀察有無明顯病變，并取腦、胸腺、心、肝、脾、腎等臟器稱質量，計算臟體比，臟體比=器官重/小鼠體重 ×100%。血液室溫靜置1 h后，3 000～4 000 r/min離心，取上清，-20℃保存，用于生化指標測定。血清AST，ALT采用全自動生化分析儀進行分析[14-15]。

3.4 重要臟器形態學觀察

小鼠給藥后14天，脫頸致死，速取心、腦、肺、肝、脾、腎新鮮組織，于10%福爾馬林固定，常規浸蠟包埋5 μm切片，切片脫水脫蠟，蘇木素-伊紅(Hematoxylin- Eosin，HE)染色[16]。

3.5 統計學分析

4 實驗結果

4.1 各劑量組小鼠一般觀察

給藥后各劑量組小鼠體型正常，背不弓起，行動迅速，被毛濃密有光澤，呼吸正常，食欲良好，糞便顏色、質地正常。外觀形態與對照組無區別。

4.2 小鼠臟體比

靈芝菌粉一次性給藥14天后，各劑量組各器官外觀顏色、大小均正常，未見明顯萎縮、水腫、滲出、增生等病變。各劑量器官指數與對照組比較均無顯著差異(見表1)。

表1 靈芝菌粉對小鼠器官指數的影響

4.3 小鼠血清生化指標

天冬氨酸轉氨酶(AST或GOT)和丙氨酸氨基氨酶(ALT或GPT)合稱轉氨基酶，肝受損后，內源性轉氨酶釋放到細胞外，使得血清中的轉氨酶水平成為肝臟損傷的重要指標[12]。與對照組相比，給藥后低劑量組小鼠血清AST、ALT均未出現顯著差異(見表2)?？梢婌`芝菌粉對小鼠血液生化指標無明顯影響。

表2 靈芝菌粉對小鼠組織血清生化指標的影響

4.4 主要臟器病理學檢查

對照組的心肌細胞正常，肝細胞輪廓清晰，可見核仁，中央靜脈完整，肺被膜完好，肺泡間隔內有少量淋巴細胞浸潤，腎組織結構完整，腦組織皮層可見典型的椎體細胞，膠質細胞排列整齊，高劑量組5 000 mg/kg小鼠的心、肝、肺、腎、腦切片染色后光鏡檢查結果也未見任何特異性病理改變。

綜上，靈芝菌粉在最高劑量5 000 mg/kg給藥時，小鼠生長良好，臟體比、血清生化指標與對照組比均無顯著差異(P>0.05)，主要器官病理組織學檢查結果也表明靈芝菌粉對受檢臟器無明顯損害，因此有著良好的口服安全性。

5 結 語

靈芝孢子粉的急性毒性試驗是學生十分感興趣的選題，激發了學生的求知欲，從實驗設計到結果分析學生感到有較大的挑戰性，實驗技能得到了提高。通過文獻調研，學生對藥物急性毒性研究的基本概念、基本原則和主要研究內容和實驗方法，有了較全面的學習；實驗實施過程中，小鼠灌胃、取血、解剖取材等實驗動物基本技能操作得到了復習鞏固，此外學生還接觸了血清生化測定、病理切片染色等多門學科綜合實驗技術技能，培養了動手實踐能力、創新意識及科研興趣。

當然在設計性實驗過程中也發現了一些問題，例如：設計實驗方案時，很多學生沒有考慮到藥食用菌的低(無)毒，設計了LD50這個指標；取血經驗不夠，導致有些小鼠取血量偏少；取材過程中未將器官取完整造成實驗誤差，另外統計技能的缺乏也是學生進行數據處理的主要障礙。盡管本實驗還有一些不盡如人意的地方，但是通過實踐與摸索，該實驗將不斷完善。