游泳運動對異育銀鯽“中科3號”甲狀腺激素代謝的影響

王海珊，李長江，湯 蓉，李大鵬，梁 驍，熊 梅，Kommaly Onxayvieng,3，李 莉

(1.華中農業大學水產學院，水產養殖國家級實驗教學示范中心， 池塘健康養殖湖北省工程實驗室，武漢 430070； 2.宜昌市水產技術推廣站，湖北宜昌 443003； 3.Department of Livestock and Fisheries,Ministry of Agriculture and Forestry,Vientiane,Lao PDR)

游泳運動作為魚類的生態習性，影響著魚體內多種生理生化過程[1]。適度的游泳運動行為可以提升魚類的生長性能，改善肌肉品質，增強免疫力等[2-4]。運動對魚類所產生的各種有益生理效應可以視為動物福利改善的指標[5]。甲狀腺激素(THs)對魚類具有廣泛的生物學作用，參與了生長、生殖、發育等多種生命活動[6-9]。甲狀腺激素主要包括四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)。T3發揮著甲狀腺激素的生物活性作用，它主要是由T4在外周組織內通過脫碘酶(IDs)催化脫碘作用產生[10,11]。運動對調控動物甲狀腺機能方面具有一定作用。Kiessling等[12]在對全雌大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)的研究中發現，游泳運動可以提高血液T3含量以及T3/T4的比值[12]。

異育銀鯽“中科3號”(Carassiusauratusgibeliovar.CAS Ⅲ)是異育銀鯽第三代新品種，具有遺傳性狀穩定、生長速度快、出肉率高等特點[13]。目前，該品種已在全國多個省市廣泛養殖。本研究以異育銀鯽“中科3號”為研究對象，通過設置不同水流速度來使魚類產生游泳運動，從而探究游泳運動對異育銀鯽甲狀腺激素水平及其代謝調控的影響，為魚類的健康養殖實踐提供基礎科學數據。

1 材料和方法

1.1 實驗魚和馴養

異育銀鯽“中科3號”幼魚購自湖北省黃石市富爾水產苗種有限公司。試驗前，將實驗魚在華中農業大學水產學院室內循環水養殖系統內暫養4周。暫養期間控制循環水水溫在(28.0±0.5) ℃，pH為7.30±0.07，溶氧水平保持在6.7 mg/L左右。實驗魚被每天飽食投喂3次，分別是08：00、14：00和18：00，投喂1 h后立即清除養殖系統內的殘餌和糞便，每日換水量約為養殖水體的10%。

1.2 實驗裝置與實驗設計

1.2.1 實驗裝置

實驗采用自主設計的環流水養殖裝置(圖1)，養殖缸呈直徑85 cm的藍色塑料圓柱形，養殖水位高40 cm，養殖缸中間加入直徑25 cm的空心PVC管并配備相應尺寸管帽。養殖缸右側用吸盤吸附可調節水流量潛水泵(功率25、100、150 W；型號HJ-1500、HJ-5500、HJ-6000，森森集團股份有限公司)，不同實驗組配備不同功率的潛水泵以營造不同的水流速度環境。

1.2.2 實驗設計

挑選體質量(99.47±10.22)g，體長(14.58±0.07)cm的健康異育銀鯽“中科3號”幼魚192尾，隨機分為1個靜水對照組和3個游泳運動組。對照組流速為0 bl(體長)/s，運動組的流速分別為0.5、1.0和2.0 bl/s，每組設置3個平行實驗缸，每個實驗缸內放養16尾魚。在正式實驗前3 d，逐步提高水流訓練的時間，直至達到正式游泳所需的18 h。每天檢測養殖缸內水流速度，選取水體底部、中部和頂部三個水位檢測取平均值，由LS300-A型便攜式流速測算儀(南京卓瑪機電有限公司)測定大小。

在實驗過程中，隨著魚體的生長，流速根據其體長每2周調整1次。每天飽食投喂3次，投喂期間各組水環境均保持靜水狀態，投喂1 h后立即清除養殖系統內的殘餌和糞便。在游泳組中，每天的流速保持18 h，其他時間關閉水流，即實驗魚的游泳時間為18 h/d。實驗時間為8周。

圖1 環流水養殖系統設計圖Fig.1 The scheme of water circulation in the experimental tank

1.3 樣品采集

1.3.1 血液樣品

流水訓練8周后，進行取樣。每個平行實驗缸取12尾魚，即每個處理組取36尾魚。采用MS-222(120 mg/L)麻醉實驗魚，每尾魚用不加抗凝劑的注射器自尾靜脈取血1～3 mL，3 500g離心20 min后，取上層血清，保存于-80 ℃下用于激素測定。

1.3.2 組織樣品

訓練8周后，每缸隨機選取12尾魚，采用MS-222(120 mg/L)麻醉。每尾魚分別采集肝組織以及下頜部第1至第3對鰓弓的交叉處組織(甲狀腺濾泡聚集處)樣品。將樣品于液氮中速凍后，保存在-80 ℃超低溫冰箱中以待測定。

1.4 測定方法

1.4.1 血清皮質醇含量的測定

采用放射性免疫測定法測定血清皮質醇(Cor.)含量，使用皮質醇放射性免疫試劑盒(北京北方生物技術有限公司，批號20171010)進行測定。應用免疫競爭機制原理，標準或樣品中的Cor.和加入的125I-Cor.共同與定量的特異性抗體產生競爭性免疫反應。125I-Cor.與抗體的結合量與標準或樣品重Cor.的含量呈一定的函數關系。用免疫分離試劑(PR)將結合部分(B)與游離部分(F)分離后，測定結合部分的放射性強度，并計算相應結合律B/B0。用已知標準Cor.含量與對應結合律作圖，即得標準已知曲線。從標準曲線上查知對應結合率的待測樣品重Cor.含量。

1.4.2 血清甲狀腺激素與促甲狀腺激素含量的測定

血清T3、T4、FT3和FT4含量采用酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒(北京北方生物技術研究所，批號20060009)測定，TSH含量用放射免疫法(RIA)檢測試劑盒(北京北方生物技術研究所，批號20180424)測定。

1.4.3 脫碘酶活性的測定

肝臟組織中加入0.1 mol/L PBS，1 mmol/L DTT，2 mmol/L EDTA，pH7.0的緩沖液進行勻漿，12 000g室溫下離心20 min，取上清液，得到10%的組織勻漿液。勻漿液快速冷凍于液氮中，在-80 ℃下保存。10%肝勻漿液采用Bradford蛋白測定試劑盒(南京建城研究所)測定蛋白質濃度。

脫碘酶(IDs)分為三種類型，分別是Ⅰ型脫碘酶(ID1)、Ⅱ型脫碘酶(ID2)和Ⅲ型脫碘酶(ID3)。按照如下成分制備ID1、ID2和ID3的孵育液。ID1孵育液：50 000 cPm125I-rT3，0.10 μmol/L rT3，15.00 mmol/L DTT；ID2孵育液：50 000 cPm125I-T4，1.00 μmol/L T4，30.00 mmol/L DTT；ID3孵育液：150 000 cPm125I-T3，1.00 μmol/L T3，30.00 mmol/L DTT。將200 μL肝勻漿液和200 μL不同的孵育液分別在放免管中于37 ℃下孵育120 min，對照組用勻漿緩沖液代替肝勻漿液，反應步驟和條件不變。

孵育液結束后，在每管中加入200 μL 4 ℃的5% BSA(w/v)溶液使反應停止，然后加入200 μL 10% TCA使蛋白沉淀，在3 500g離心30 min。用GC-911型恪β放射免疫計數器測量總放射性和上清液放射性的cPm值，脫碘酶的活性計算公式如下：

其中SCc=SC-BC；BC：對照管的放射性計數；SC：樣品管的放射性計數；TC：總放射性計數；SA：孵育液中反應底物的含量/TC。碘甲狀腺原氨酸的單位活性以每分鐘每毫克蛋白釋放出的I-1的飛摩爾(fmol I-1released/(mg Pro·min))表示。

1.4.4 甲狀腺激素代謝調控相關基因表達量的測定

使用組織研磨儀在冰浴條件下，根據RNAiso試劑(TaKaRa,Shuzo,JaPan)使用說明進行肝臟與垂體總RNA的提取。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，用NanoDroP 2000 核算分析儀(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)檢測其濃度。使用HifairTMⅡ1 standard cDNA synthesis suPermix (Yisheng,Shanghai,China)反轉錄試劑盒進行反轉錄第一鏈cDNA的合成。

從GenBank中公布的鯽甲狀腺內分泌系統與生長相關基因核心序列片段設計引物，測定鯽肝臟中id1、id2、id3、ttr、tr-α、tr-β基因的表達情況，選取β-actin為內參基因，引物序列如表1所示。

用HifairTMqPCR SYBR熒光染料(上海翊圣)進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃(β-actin)、60 ℃(id1)、58 ℃(id2)、60 ℃(id3)、58 ℃(ttr)、55 ℃(tr-α)、58 ℃(tr-β)，4 ℃退火，72 ℃延伸20 s，擴增40個循環，目的基因的表達分析采用2-△△ct法。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4.5 甲狀腺組織學觀察

采集異育銀鯽第1至第3對鰓弓的入鰓動脈和腹大動脈交叉處(鯽甲狀腺濾泡主要集中處)組織，固定于4%多聚甲醛中，采用組織學石蠟切片技術和蘇木精-伊紅染色法，使用Nikon EcliPse 80i顯微鏡進行甲狀腺組織學結構特性的觀察。參考劉子棟等[24]的方法，通過測量細胞核的長徑和短徑來對甲狀腺濾泡細胞核的大小進行定量評估，每個實驗組統計3個切片樣品數，每片共計數25個細胞核，運用橢圓公式(π×長軸長×短軸長/4)計算細胞核大小。

1.4.6 數據統計分析

實驗中所有數據先用Excel進行初步處理，實驗數據采用平均數±標準差(mean±SD)來表示，用SPSS 19.0軟件進行實驗數據的統計和分析。在檢測實驗數據的正態分布和方差齊性后，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行顯著檢驗，用鄧肯檢驗法(Duncan)進行多重比較分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 血清皮質醇、甲狀腺激素和促甲狀腺激素水平

游泳訓練8周后，各組血清皮質醇含量基本保持穩定水平，各實驗組之間并無顯著性差異(表2)。游泳運動對實驗魚血清甲狀腺激素水平產生了比較顯著的影響(表2)。與對照組相比，血清T4與T3的含量在運動組均有上升，在0.5 bl/s運動組有顯著上升，但1 bl/s和2 bl/s運動組與對照組之間沒有顯著性差異。8周游泳運動后，2 bl/s運動組的血清FT4含量顯著高于對照組和其他運動組。此外，血清FT3含量在對照組與三個游泳運動組間不存在顯著性差異。游泳運動也改變了實驗魚血清TSH的水平,其在0.5 bl/s與1 bl/s運動組中出現了顯著性上升的現象(表2)。

表2 不同水流速度對異育銀鯽血清皮質醇、甲狀腺激素和促甲狀腺激素水平的影響

2.2 肝臟脫碘酶活性

與對照組相比，ID1活性在0.5 bl/s運動組顯著上升，但1 bl/s和2 bl/s運動組與0 bl/s對照組之間沒有顯著性差異。隨著流速的增長，ID2活性呈逐漸上升趨勢，但各個實驗組間無顯著性差異。ID3活性隨著流速的上升而下降，1 bl/s和2 bl/s運動組中ID3的活性顯著低于0 bl/s對照組，0.5 bl/s組與0 bl/s組之間無顯著性差異 (圖2)。

圖2 不同水流速度對異育銀鯽肝臟脫碘酶活性的影響Fig.2 The effect of swimming on the activity of iodothyronine deiodinase of C.auratus gibelio under different water velocity

2.3 甲狀腺激素代謝相關基因表達量

tr-αmRNA相對表達量在2 bl/s運動組中顯著性上升，且0 bl/s對照組和0.5 bl/s、1 bl/s運動組之間無顯著性差異。tr-βmRNA相對表達量在各實驗組間無顯著性差異 (圖3)。

id1 mRNA相對表達量在1 bl/s運動組中顯著上升，顯著高于0 bl/s對照組和0.5 bl/s、2 bl/s運動組，且后三組間無顯著性差異。id2和ttr的mRNA相對表達量在各組見無顯著性差異。同時，id3 mRNA相對表達量在2 bl/s運動組中顯著性高于對照組和0.5 bl/s、1 bl/s運動組 (圖3)。

2.4 甲狀腺組織學結構

異育銀鯽甲狀腺濾泡內充滿了均勻的膠質。各個實驗組的魚類甲狀腺濾泡上皮細胞保持正常形態結構，未發生顯著改變(圖4)。但相比于對照組，運動組中異育銀鯽甲狀腺濾泡上皮細胞的細胞核顯著性增大 (圖5)。

3 討論

血液皮質醇水平常被用作反映魚類應激狀態的內分泌指標。當魚類產生應激反應時，血漿皮質醇水平會顯著升高[14,15]。Young等[16]的研究表明，在面對捕撈和擁擠脅迫后0.5 h，條紋鱸魚(Moronesaxatilis)血漿皮質醇含量顯著性升高。脅迫后4 h，野生條紋鱸魚以及經過游泳運動的魚血漿皮質醇含量均恢復到應激前水平，對照組血漿皮質醇含量依舊顯著性高于脅迫前水平。Woodward等[17]的研究結果同樣示，經過運動訓練后的虹鱒(Salmogairdneri)在面對游泳應激壓力時表現出更好的抗應激能力。本研究發現，在經過8周的游泳運動后，異育銀鯽“中科3號”血清皮質醇含量均保持正常水平，與對照組并無顯著性差異。由此表明，實驗魚能夠長期適應不高于2 bl/s的水流環境。

圖3 不同水流速度對異育銀鯽肝臟中tr-α，tr-β，ttr，id1，id2與id3基因表達的影響Fig.3 Transcript abundance for tr-α，tr-β，ttr，id1，id2 and id3 in liver of C.auratus gibelio under different water velocity

圖4 不同水流速度對異育銀鯽甲狀腺濾泡組織 結構的影響Fig.4 The effect of different water velocity on the histological structure of thyroid follicles in C.auratus gibelio A：0 bl/s；B：0.5 bl/s；C：1 bl/s；D：2 bl/s；CO：膠質。

圖5 不同水流速度對異育銀鯽甲狀腺濾泡細胞核 大小的影響Fig.5 The effect of different water velocity on the histological structure of thyroid follicles in C.auratus gibelio

魚類甲狀腺機能主要受下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT)的調控，并通過HPT軸維持外周循環系統甲狀腺激素代謝的穩態。與其他脊椎動物不同，魚類的甲狀腺幾乎不合成T3，只合成T4，其分泌活動受到垂體分泌的促甲狀腺激素(TSH)的調控[18]。TSH含量的改變對甲狀腺激素(THs)的合成與釋放具有重要的作用[19,20]。在本研究中，游泳運動改變了異育銀鯽血清TSH的含量，使其在游泳運動組積累增多，并且血清THs在游泳運動組顯著性升高。說明可能是由于運動訓練刺激了下丘腦與垂體對TSH的釋放，從而促進了下游THs的積累。

在生物體內，T3是主要發揮生物活性的甲狀腺激素形式，主要是由外周組織中的T4與TTR結合后轉運至外周組織，通過脫碘酶(IDs)的外環脫碘作用轉化而來。IDs對外周組織內TH的代謝具有重要的調控作用[11]。ID1具有催化T4外環脫碘形成T3和催化T4內環脫碘形成反T3(rT3)的雙重特性。本研究中，ID1活性在0.5 bl /s流速組中顯著性升高，這與血清T4與T3含量在0.5 bl s-1運動組顯著性升高表現一致。可能是由于ID1活性的升高，增加了T4向T3的外環脫碘轉化，提升了機體T3水平。同時，ID2也具有催化T4和rT3的外環脫碘作用。Yan等[21]認為，相比于ID1，只具有外環脫碘作用的ID2可以更專一地在調節機體T3含量方面發揮作用[21]。但在本研究中，雖然游泳運動組ID2活性出現了上升，但與對照組相比并無顯著性差異。可能是由于不同的研究對象與處理條件引起的，本研究中ID1發揮了更大的作用。此外，承擔催化T4和T3內環脫碘作用的ID3活性在游泳運動組顯著性降低，由于ID3具有催化THs失活降解的作用，機體可能是通過減少THs的降解從而促進了訓練組血清THs的積累。由此可見，運動訓練引起了外周THs代謝過程中的一系列酶活性的改變增加了T4向T3增強以及T3降解代謝減弱，從而促進了機體內T3水平的升高。

THs通過與血漿中的甲狀腺激素轉運蛋白(TTR)結合進行轉運，實現脫碘以及向靶組織器官運輸的調節作用，對維持甲狀腺組織外的THs含量起到了十分重要的作用[21,22]。有關研究表明，微囊藻毒素的暴露引起斑馬魚(Daniorerio)機體ttr基因表達水平的升高，同時引起T3與FT3含量的降低，是由于TTR與T3結合水平升高導致的[23]。在本實驗中，肝臟ttr基因表達水平在各個實驗組間無顯著性差異游泳運動組升高的T4含量，促進了FT4的積累。THs與細胞內甲狀腺激素受體(TRs)結合形成激素受體復合物，然后進一步調控下游基因的表達[24]。甲狀腺激素受體包含兩種類型，即TR-α與TR-β，其mRNA水平受到體內甲狀腺激素的調節。tr基因的表達水平會影響其與THs的結合，從而影響THs生物學效應的發揮[24,25]。水流刺激下，異育銀鯽的THs代謝在不同的流速下表現出不同的響應形式，如TRs上調或T3水平升高。TRs表達上調以及T3水平升高，都有助于THs生物學效應的發揮。因此，水流刺激銀鯽增加游泳時間，可以鍛煉魚類起到促進TH發揮生物學效應，更好地調控魚類的生長代謝。

與哺乳動物不同，常見淡水魚類的甲狀腺并不是一個單一實質腺體，而是由一些散布的甲狀腺濾泡組成。在正常的生理活動下，由單層上皮細胞構成的甲狀腺濾泡內布滿了膠質，是甲狀腺激素合成與貯藏的主要位置[6]。在本研究中，我們發現各個實驗組中的甲狀腺濾泡內膠質分布均勻。運動訓練組中甲狀腺濾泡上皮細胞細胞核出現增大現象，可能是由于血清中TSH含量過高對甲狀腺組織的反饋作用，表明游泳運動增加了異育銀鯽甲狀腺組織的代謝功能[27]。

總體來講，游泳運動可以通過調控TSH的分泌促進TH的合成，并通過調節外周組織的IDs活性來改變異育銀鯽外周循環系統內的THs含量。適度的游泳運動可以促進異育銀鯽甲狀腺激素的代謝，提高其甲狀腺機能，對提升其生理健康具有一定的促進作用。