不同ELISA系統檢測人血清百日咳IgG抗體的比較研究

衛 辰，晁 哲，吳 燕，駱 鵬，王麗嬋，馬 霄

(中國食品藥品檢定研究院/衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室,北京 102629)

我國和大多數發達國家如美國、歐盟、日本等國都在使用不良反應小的無細胞百日咳、白喉和破傷風聯合疫苗(DTaP)。與西方國家使用的將百日咳鮑特氏菌有效抗原分別層析純化、精確配比的組分無細胞百白破疫苗(DTacP)不同，占DTaP市場95%的國產疫苗仍然是使用傳統的蔗糖密度梯度離心混合提純，抗原成分復雜且各組分占比不固定的共純化DTaP。DTacP各抗原的純度在95%以上，根據配方不同包括1～5種百日咳鮑特氏菌抗原蛋白[1-2]，而共純化DTaP要求蛋白總純度在85%以上，通常只包括百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，偶爾也包括少量黏附素(PRN)和微量的菌毛Fim2/3型。目前我國10多家企業均在研發新純化工藝的DTacP和以DTacP為基礎的多聯疫苗[1]，眾多研發中的DTacP多聯疫苗和已上市產品都需要進行臨床試驗，檢測血清中抗百日咳鮑特氏菌抗原的IgG抗體以判定疫苗有效性。百日咳疫苗臨床試驗使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，以WHO百日咳抗血清國際標準品(06/140)和從國際標準品溯源的第1代人源百日咳抗血清國家參考品為標準，對血清樣品進行酶標抗體單位值測定，結果由酶標IgG抗體值和轉陽率判定。目前，我國臨床血清百日咳抗體ELISA試驗的檢測用抗原并沒有國際和國家統一的參考品，以往臨床試驗多由廠家自己提供臨床檢測用抗原[3]。隨著臨床試驗設計更加復雜和完善，可能需要多組對照疫苗。疫苗臨床試驗不再是2個廠家之間樣品免疫效果的比較，而是多個廠家、多個工藝、多種抗原構成的樣品之間的比較。ELISA包被抗原的選擇可能會影響到臨床試驗檢測結果，進而影響到整個臨床試驗的成功與否。并且在百日咳疑似病例的臨床血清學診斷中，不同來源包被的百日咳抗原也將影響到血清陽性結果的判定，繼而影響百日咳疾病的確診和發病率統計。本研究參考之前有關ELISA系統比較的文獻，使用3組不同來源共10個百日咳鮑特氏菌有效組分抗原PT、FHA和PRN對同一組國產共純化DTaP臨床基礎免疫血清進行ELISA檢測[4-7]，并對結果進行比較研究，也是國內首次對共純化DTaP的PRN抗體進行檢測研究。現報道如下。

1 試劑與方法

1.1樣品 中國食品藥品檢定研究院保存的共純化DTaP基礎免疫臨床血清樣本164對，包括免疫前和免疫后血清。

1.2試劑與儀器

1.2.1ELISA包被抗原 國內公司A提供3種液體保存抗原，以A表示：PT(A1-201701)、FHA(A2-201702)、PRN(A3-201703)；國際公司B提供3種液體保存抗原，以B表示：PT(B1-200603)、FHA(B2-200401)、PRN(B3-200601)；中國食品藥品檢定研究院提供4種凍干抗原，其中FHA 2種抗原，以C表示：PT(C1-200701)、FHA(C2-200702)、FHA(C3-20140524)、PRN(C4-201606001)。

1.2.2標準血清 WHO百日咳抗血清國際標準品(06/140)，每支單位值(PT335 IU，FHA130 IU，PRN65 IU)。

1.2.3其他主要試劑耗材及儀器 PBS(MP 0218054991)；吐溫20(MP 103168)；酶標山羊抗人IgG結合物(Invitrogen A24524)；顯色底物OPD(Sigma P9187)；96孔酶標板(Greiner，655080)；血清稀釋板(Greiner公司)；酶標儀(Molecular SPECTRA MAX LPOS)。

1.3方法 3種抗原均以3 μg/mL的濃度用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液包被酶標板，每孔100 μL，4 ℃過夜。PBST洗板3次，加入0.5%的BSA稀釋液，將預先稀釋20倍的免疫后樣品血清，以1/20的比例加入酶標板第一行的A1-A11孔中，免疫前血清不稀釋直接加入孔中，A12孔中加入200倍稀釋的標準血清，酶標板自上而下倍比稀釋，37 ℃，1 h；洗板，加入已稀釋好的二抗，37 ℃，1 h；再次洗板，加入底物液，室溫避光15 min；2 mol/L硫酸終止，在450 nm讀取吸光度值。采用酶標儀分析軟件，運用四參數法繪制標準曲線，計算每份血清中PT、FHA、PRN的抗體值。免疫前免疫后血清使用全部抗原進行檢測。

1.4統計學處理 以免疫前血清為基準，對3種抗原檢測的免疫后血清計算轉陽率。陽轉標準為PT的IgG抗體>20 IU/mL，FHA的IgG抗體>20 IU/mL，PRN的IgG抗體為免疫后4倍增長；PT及FHA免疫后IgG抗體未達到20 IU/mL的樣品若達到免疫后抗體四倍增長也判定為陽轉[3]。對不同抗原包被的抗體檢測結果轉陽率采用χ2檢驗。對3組免疫后數據抗體幾何均值(GMC)采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，用單因素方差分析進行多組差異比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水平α=0.05。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1試驗的有效性 10種抗原包被的酶標板陽性血清稀釋度符合四參數方程分析要求，R2>0.95，各個系統試驗結果有效。

2.2人抗百日咳IgG抗體測定結果分析

2.2.1免疫前抗體水平及不同ELISA抗原檢測的抗體轉陽率及保護率比較 基礎免疫前血清抗體水平及陽性率極低，不同抗原檢測轉陽率一致。免疫前血清PT和FHA的IgG抗體分別有1例和2例陽性，陽性率PT為0.6%，FHA為1.2%，PRN為0.0%。在免疫后的164份血清中，PT抗體用A1檢測為100.0%陽性，用B1和C1檢測均有1例未到達20 IU/mL且沒達到4倍增長，轉陽率為99.4%；FHA抗體用A2、B2、C3檢測為100.0%陽性，用C2檢測有8例未到達20 IU/mL且沒達到4倍增長，轉陽率為95.1%；PRN抗體A3和B3檢測為100.0%陽性，用C4檢測有2例未達到4倍增長，轉陽率為98.78%。對轉陽率做χ2檢驗，PT和PRN的轉陽率差異無統計學意義(χ2=1.004，P=0.605；χ2=4.016，P=0.134)。FHA的轉陽率經χ2檢驗,FHA抗體轉陽率差異有統計學意義(χ2=24.296，P=0.000)。見表1。

表1 不同ELISA體系檢測轉陽率比較

注：*表示有C2和C3 2個FHA抗原，C3抗原的FHA抗體檢測結果單獨列出

續表1 不同ELISA體系檢測轉陽率比較

圖1 不同ELISA檢測體系GMC及置信區間

2.2.2不同抗原檢測的抗體GMC水平及相關性分析 免疫前血清PT、FHA、PRN的GMC分別為2.52 IU/mL、2.09 IU/mL和1.17 IU/mL。免疫后血清PT抗體檢測結果為A1(82.19 IU/mL)、B1(95.59 IU/mL)和C1(60.74 IU/mL)。免疫后血清FHA抗體檢測結果為A2(81.66 IU/mL)、B2(57.39 IU/mL)、C2(29.33 IU/mL)和C3(53.32 IU/mL)。免疫后血清PRN抗體檢測結果為A3(39.34 IU/mL)、B3(40.76 IU/mL)和C4(34.05 IU/mL),見圖1。對免疫后血清PT、FHA和PRN結果分別進行方差分析。3組PT抗體檢測結果之間差異有統計學意義(F=65.09，P<0.05)，事后LSD-t檢驗兩兩結果之間差異有統計學意義(P<0.05)。4組FHA抗體檢測結果之間差異有統計學意義(F=218.49，P<0.05)，事后LSD-t檢驗B2和C3結果差異無統計學意義(P>0.05)，其余兩兩結果之間差異有統計學意義(P<0.05)。3組PRN抗體檢測結果之間差異有統計學意義(F=21.28，P<0.05)，事后LSD-t檢驗A3和B3結果差異無統計學意義(P>0.05)，其余兩兩結果之間差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

國內共純化DTaP疫苗生產均使用來源于中國食品藥品檢定研究院的百日咳CS株，國外DTacP疫苗生產使用百日咳Tohoma株，2種百日咳菌基因序列有一定區別[8]。公司A和中國食品藥品檢定研究院的ELISA檢測用百日咳抗原均由CS株發酵后層析純化得到，公司B ELISA檢測用抗原由Tohoma株發酵后層析純化得到。菌株、發酵條件、純化工藝的不同意味著抗原結構可能有所不同。共純化工藝中百日咳鮑特氏菌抗原混合脫毒，會導致不同抗原蛋白在戊二醛作用下互相交聯形成復雜結構，其抗原表位與DTacP生產工藝中分別純化脫毒的組分抗原的表位有著較大區別。抗原結構、抗原含量和佐劑含量的區別通常會導致共純化百日咳疫苗臨床血清與未經脫毒處理的純化抗原結合，通常會弱于DTacP臨床血清。本次臨床血清檢測使用的包被抗原中，A公司抗原為2017年新制備的液體保存抗原；B公司為2004-2006年制備的液體保存抗原；中國食品藥品檢定研究院PT-C1和FHA-C2均為2007年制備的凍干保存抗原，由于剩余量不足，FHA試劑已更換為2014年制備C3凍干抗原，PRN-C4為2016年制備的凍干抗原。使用中國食品藥品檢定研究院2種FHA試劑抗原檢測臨床血清結果和轉陽率有顯著性差異，表明FHA-C2與其他FHA抗原結構有較大區別，分析原因可能是我國10年間的純化工藝改變導致FHA的結構發生了一定變化，對抗原抗體結合有一定影響。3組抗原在檢測PT、FHA和PRN 3種抗體GMC之間差異有統計學意義。本研究結果說明同樣的臨床血清，同樣的試驗方法，同樣的酶標二抗和顯色底物的前提下，不同來源的PT、FHA、PRN抗原檢測的IgG抗體GMC結果有顯著性差異。因此，不同來源的百日咳抗原檢測的人百日咳血清IgG抗體結果不具備直接可比性，轉陽率略有差別，各個公司產品用本公司ELISA檢測系統會得到更高的抗體結果和轉陽率。為了使不同公司產品臨床檢測血清的檢測結果更加客觀、公平、公正和具有可比性，應統一推廣使用中國食品藥品檢定研究院的C組ELISA系統進行檢測。

2007年以來已發表的DTaP臨床研究文獻表明，以往采用ELISA方法檢測不同公司在國內的臨床血清樣本時，國內公司通常使用中國食品藥品檢定研究院統一的包被抗原的試劑，而國外公司則使用本公司包被抗原[9-14]。共純化DTaP只檢測PT和FHA抗體，故未有PRN抗體相關的報道，PT抗體為33～97 IU/mL，FHA抗體為25～59 IU/mL。本研究結果顯示PRN抗體為34.05 IU/mL，該結果可以對未來我國DTacP的臨床試驗提供參考數據。與國外公司DTacP臨床結果相比，共純化百日咳疫苗FHA抗體普遍存在較大差距，提示國內DTacP研發企業對此需要足夠關注。

我國有10余家公司在研發DTacP和以此為基礎的多聯疫苗，已有5家公司取得臨床批件。除了臨床試驗以外，基層醫院和疾病預防控制中心部門都急需人百日咳血清抗體的檢測以協助臨床確診病例。隨著主動監測向縣一級疾病預防控制中心部門的擴大，需要統一的百日咳組分標準抗原，配合我國己制備的人源百日咳抗血清國家參考品[15-16]。

4 結 論

建立標準化的人百日咳血清IgG抗體檢測ELISA體系，將使我國臨床試驗和疾病監測結果更具有真實性和可比性，使百日咳血清診斷更加科學和規范。