2種方法測定急性腦梗死患者蛋白C抗凝活性比較分析

李 蕾，馬 靜，楊 旭，王曉琳，洪 萍，王培昌

(首都醫科大學宣武醫院檢驗科，北京 100053)

蛋白C是體內一種重要的抗凝血因子，其抗凝活性占全血的20%～30%。蛋白C缺乏在健康人群中的檢出率為0.2%～0.4%，在血栓癥患者中的發病率為5%～15%，在靜脈血栓栓塞癥患者的檢出率為2.3%～3.3%[1]。而我國蛋白C缺乏檢出率為2.26%[2]。由于大部分患者臨床表現輕微甚至無明顯臨床表現，2%的蛋白C缺乏癥有明顯而嚴重的臨床癥狀，如深靜脈血栓形成、彌散內血管內凝血等血栓性疾病[3]，因此，對體內蛋白C的檢測具有重要的臨床意義。蛋白C抗凝活性檢測主要是發色底物法和凝固法，目前不同實驗室和儀器對蛋白C抗凝活性的檢測方法尚不統一[4-6]，并且國內用2種檢測方法針對某一疾病進行蛋白C抗凝活性分析的研究較少。本研究針對本院健康人群和急性腦梗死患者，分別采用發色底物法和凝固法檢測蛋白C抗凝活性并進行方法學比較，以確定2種方法在臨床應用中的可交換性和替代性，為臨床應用分析提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年7-12月首都醫科大學宣武醫院神經內科住院的急性腦梗死患者160例為疾病組，其中男82例，女78例，年齡46～86歲，平均(67.34±19.09)歲。納入標準：(1)首次發作；(2)發病時間≤48 h；(3)符合1995年中華醫學會第4屆全國腦血管病學術會議制訂的各類腦血管疾病診斷要點；(4)所有患者均經頭顱CT或MRI檢查確診。排除標準：(1)接受早期再灌注治療；(2)頭部CT或MRI證實有腦出血；(3)腫瘤、免疫性疾病、嚴重感染、急性心肌梗死、肝腎疾病；(4)入院前1周內曾使用抗血小板或抗凝藥物。以同期本院體檢中心體檢健康者134例為對照組，男54例，女46例，年齡48～85歲，平均(65.84±20.61)歲,所有患者無血液系統疾病、免疫性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤、顱腦損傷、腦腫瘤、蛛網膜下腔出血及嚴重心、肺、腎等臟器功能障礙等病史。2組年齡、性別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 STAGO-R全自動凝血分析儀；STAGO配套的原裝試劑，蛋白C發色底物法試劑盒(批號：250183)，蛋白C凝固法試劑盒(實驗方法)，STAGO系統質控品(批號：115020)，STAGO校準品(批號：252572)。

1.3方法 收集研究對象抗凝血標本，枸櫞酸鈉抗凝劑與全血比例為1∶9，標本無溶血、脂血、黃疸，3 000 r/min離心10 min后吸取血漿，保存于-80 ℃冰箱內。檢測前待測標本置于37 ℃水浴箱內復融，在STAGO-R全自動凝血分析儀上用2種檢測方法進行測定，嚴格按照廠家的操作說明書操作。目前對于蛋白C的篩查比較推薦的方法是發色底物法[7]，選擇發色底物法作為比較方法(x)；而凝固法作為實驗方法(y)。實驗前均對檢測系統進行校準和質控，確保在控時進行實驗，以此保證數據的準確性。

2 結 果

2.12種方法差異性分析 應用配對t檢驗對所有入組人群、對照組和疾病組采用發色底物法與凝固法測得的蛋白C抗凝活性數據進行差異性分析，結果提示以上3組發色底物法與凝固法之間差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，疾病組蛋白C抗凝活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2種方法測定蛋白C抗凝活性的比較分析

注：與發色底物法相比，*P>0.05；與對照組相比，#P<0.05

2.22種方法相關性分析 以發色底物法為比較方法x，凝固法為實驗方法y，應用Pearson相關性分析進行比較，結果顯示所有入組人群用2種方法測定蛋白C抗凝活性相關系數分別為r=0.870 5(P<0.001),r=0.857 0(P<0.001),r=0.882 4(P<0.001)；決定系數分別為R2=0.757 8,R2=0.734 5,R2=0.778 7；直線回歸方程分別為y=0.975 3x+1.934 5，y=0.922 6x+6.823 3，y=1.031 5x-2.790 8。Pearson相關性分析提示發色底物法與凝固法之間的相關性顯著，呈高度線性相關。見圖1～3。

圖1 所有入組人群發色底物法與凝固法相關性分析

圖2 對照組發色底物法與凝固法相關性分析

圖3 疾病組發色底物法與凝固法相關性分析

圖4 所有入組發色底物法與凝固法一致性檢驗

圖5 對照組發色底物法與凝固法一致性檢驗

2.32種方法一致性檢驗 以發色底物法與凝固法2種檢測方法測定結果的均值為x軸，2種檢測方法測定結果的差值為y軸，繪制Bland-Altman散點圖。結果顯示所有入組人群2種檢測方法差值的平均偏倚為0.3%，95%一致性界限范圍為-20.8%～21.4%，其中1.36%(4/294)的點在95%一致性界限外。在一致性界限范圍內，最大偏倚相當于均值的23.18%。對照組2種檢測方法差值的平均偏倚為0.4%，95%一致性界限范圍為-20.8%～21.6%，其中2.50%(4/160)的點在95%一致性界限外。在一致性界限范圍內，最大偏倚相當于均值的22.63%。疾病組2種檢測方法差值的平均偏倚為0，95%一致性界限范圍為-20.9%～20.9%，其中2.99%(4/134)的點在95%一致性界限外。在一致性界限范圍內，最大偏倚相當于均值的22.68%。以上3組數據這種相差幅度在臨床上不能接受。見圖4～6。

圖6 疾病組發色底物法與凝固法一致性檢驗

3 討 論

蛋白C是一種由肝臟產生的維生素K依賴性血漿蛋白，在凝血酶或凝血酶-血栓調節蛋白復合物的作用下轉變為活化蛋白C[8]，活化蛋白C與其輔因子蛋白S形成復合物，滅活活化FⅤ(FⅤa)和活化FⅧ(FⅧa)并增強纖溶活性，因此具有抗凝作用。當蛋白C缺乏時，FⅤa和FⅧa滅活減少、血循環纖溶能力降低，致使纖維蛋白形成過多而發生血栓[9]。

蛋白C活性的檢測大多通過商品試劑Protac?。Protac?是單鏈的蛋白酶，由銅斑蛇毒純化提取的產物。Protac?能夠極快速地激活蛋白C使之成為活化蛋白C,可以有效地排除蛋白C抑制劑對試驗的影響。發色底物法通過測定產色底物的吸光度變化來推測所測物質的含量和活性，而凝固法的測定目標為蛋白C的抗凝活性，即對凝血因子FⅤa、FⅧa的滅活能力[10]。但目前對2種方法學的比較及干擾因素的研究較少。

由于神經科學為我院國家級重點學科，本室蛋白C抗凝活性檢測人群主要來源于神經內、外科，其次是血管外科、婦產科等。病種大部分為急、慢性缺血性腦血管病，本研究疾病組選取病種為急性腦梗死患者。通過發色底物法和凝固法2種方法檢測對照組和疾病組血漿中蛋白C抗凝活性，并進行統計學分析，結果顯示在健康和特定疾病人群中不同方法測得蛋白C抗凝活性差異無統計學意義，僅凝固法測定結果略低于發色底物法。與對照組相比，急性腦梗死患者采用2種方法測定蛋白C抗凝活性均顯著降低，與以往研究結果一致[11-12]。本研究組為急性腦梗死患者可能由于血栓事件急性期蛋白C消耗，出現抗凝蛋白水平的短暫下降[13]，建議蛋白C降低患者1個月后復查，以排除易栓癥可能性。

Pearson相關分析結果表明，采用不同方法檢測蛋白C活性具有顯著的相關性和線性回歸，而Bland-Altman一致性檢驗顯示在對照組和疾病組2種檢測方法的測量結果相差幅度均較大，不能被臨床接受，因此，不能作為發色底物法的替代方法。可能由于凝固法干擾因素多，如血漿FⅧ水平升高、高脂血癥、狼瘡性抗凝物均可影響凝固法測得的血漿蛋白C活性[14]。目前認為肝素含量低于1～2 U/mL，不會影響凝固法的檢測；但是當含有阿加曲班、水蛭素、比伐盧定等凝血酶抑制劑時，會使檢測結果假性升高[15]。而發色底物法當肝素含量不超過2 U/mL時不會影響檢測結果，而且凝血酶抑制劑亦不會影響試驗。發色底物法常見的干擾酶類有凝血酶、活化的FⅩa、激肽釋放酶和組織纖維酶原激活劑等[10]。KHOR等[15]建議來自彌散性血管內凝血患者、含有組織纖溶酶原激活劑的樣本或者采血緩慢的幼兒可應用空白對照。這樣可排除干擾物質的作用，縮短報告時間，同時節省試劑成本。由于發色底物法干擾因素較少，比凝固法準確，目前對于檢測蛋白C缺乏的篩查比較推薦的方法是發色底物法[7]。此外,本研究納入數據均是單次測量，沒有采取多次測量求平均值的方法，不能消除測量隨機誤差的影響。檢測蛋白C抗凝活性的2種方法均受分析前因素和實驗室各種因素的影響，要盡量排除分析前因素影響，定期校準儀器。本次研究僅針對相對健康人和急性腦梗死患者，對于其他血栓性疾病的比對分析尚需進一步研究，以使易栓癥篩查的方法學標準化、數據精準化，更好地指導臨床診療工作。

4 結 論

實驗室在比較不同方法檢測一致性時應采取多種方法從不同角度進行聯合評價，以避免某一方法評價中局限性的影響，使評價結論更為合理、客觀。