骨髓活檢聯合多參數流式細胞術及FISH技術在慢性淋巴細胞白血病診斷中的應用

金 恂，胡永軍

(淮安市淮安醫院檢驗科，江蘇淮安 223200)

慢性淋巴細胞白血病(CLL)是臨床較為常見的老年性腫瘤疾病之一，其主要發病機制是機體B淋巴細胞發生克隆性異常增殖[1]。流行病學資料顯示[2]，90%的CLL患者的發病年齡在50歲以上，男性患者發病率高于女性[3]。臨床表現以貧血、出血及發熱為主，病因包括環境因素、遺傳性因素及病毒感染所致的免疫缺陷等。骨髓細胞形態學檢查作為血液系統疾病常見檢測方法，在臨床中的應用越來越多。但是受到骨髓結構、增生及細胞分布情況的影響，骨髓涂片往往不能準確反映患者的造血功能[4]。多參數流式細胞術對于CLL患者的免疫分型診斷具有積極的意義。熒光原位雜交技術(FISH)對間期和分裂期細胞的診斷準確、靈敏，對患者的預后具有較好的預測功能。本研究通過對骨髓活檢聯合多參數流式細胞術及FISH技術在CLL診斷中的應用分析，以期為診斷和預后判斷提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年2月至2018年2月的在本院住院治療的120例CLL患者為研究對象，依據中國CLL的診斷與治療指南和Binet分期[5]，將患者分為A期38例，B期40例，C期42例，患者平均年齡為(54.23±1.09)歲。參考歐洲白血病免疫學會分型研究3組提倡的抗原積分系統對患者進行免疫抗原分組[6]，其中未分化型患者52例，單純型患者24例，變異型患者22例，混合型患者22例。另選取本院健康體檢的老年人120例作為對照組，兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。所有患者的治療方案均為CLL ICB-FM2002。所有研究對象家屬均簽署知情同意書，并通過本院醫學倫理委員會論證通過。

患者納入標準：(1)所有患者均符合CLL診斷標準[5]，外周血淋巴細胞計數≥5×109/L；(2)外周血涂片特征性表現為小的、形態成熟的淋巴細胞顯著增多，其細胞質少、核致密、核仁不明顯、染色質部分聚集，并易見涂抹細胞，外周血淋巴細胞中不典型淋巴細胞及幼稚淋巴細胞<55%；(3)典型的流式細胞術免疫表型為CD19+、CD5+、CD23+、CD200+、CD10-、FMC7-、CD43+，表面免疫球蛋白(sIg)、CD20及CD79b弱表達(dim)；(4)均未有腫瘤遠處轉移；(5)已獲得患者及家屬知情同意。排除標準：(1)排除嚴重心臟、肝、腎功能障礙患者；(2)對本研究藥物過敏患者；(3)中途停止治療或者轉院患者。

1.2研究方法

1.2.1骨髓活檢 分別對2組患者使用骨髓活檢專用針進行髂后上棘骨髓抽吸，將抽吸好的骨髓進行涂片檢測。

1.2.2骨髓病理切片檢測 將以上獲得的骨髓樣品瑞姬氏染色，經bouin液進行固定，使用乙醇進行梯度脫水處理，石蠟包埋后，將患者的樣本進行2～3 μm及5 μm切片，2～3 μm切片進行蘇木素-姬姆薩-酸性品紅染色(HGF)，5 μm切片進行gomori網狀纖維銀染色。

1.2.3多參數流式細胞術 使用BD公司生產的FAGS Galibur型流式細胞儀對2組患者的骨髓樣本進行檢測，使用CELL QUEST軟件進行患者的骨髓形態和免疫抗原檢測。CD33抗體由上海信裕生物技術有限公司提供。

1.2.4FISH檢測 使用八探針FISH系統對患者進行骨髓檢測，分別對2組患者的骨髓形態及核酸物質(MYC、P16、E2A、CHI2/D10Z1/D17Z1、TEL/AML1、MLL、BCR/ABL1、IGH)差異進行對比分析。實驗試劑由上海起發實驗試劑有限公司提供。

1.3觀察指標 (1)骨髓細胞的形態學診斷：分別對比觀察骨髓涂片和骨髓活檢切片骨髓形態的診斷差異。(2)骨髓形態學的診斷效能比較：使用受試者工作特征曲線(ROC曲線)對患者的診斷效能進行對比觀察。(3)多參數流式細胞術對患者的檢測結果分析。(4) FISH技術檢測結果分析。

2 結 果

2.1骨髓細胞的形態學診斷比較 骨髓涂片的檢出率(83.33%)低于骨髓切片(100.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 骨髓細胞的形態學診斷比較

圖1 骨髓形態學的診斷ROC曲線分析

2.2骨髓形態學的診斷效能對比 通過對骨髓涂片和骨髓切片的ROC曲線分析，骨髓切片的診斷效能顯著高于骨髓涂片，其診斷靈敏度高于骨髓涂片，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 骨髓形態學的診斷效能比較

表3 多參數流式細胞術對患者的檢測結果分析

2.3多參數流式細胞術對患者的檢測結果分析 通過對患者進行多參數流式細胞儀檢測，CLL患者中的交叉髓系抗原以CD33(33.33%,40/120)居多，其中，未分化型患者、單純型患者、變異型患者、混合型患者均以CD33表達為主，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4FISH技術檢測結果分析 通過對患者進行FISH技術檢測，患者的核酸變異以CHI2/D10Z1/D17Z1多倍體(46.67%，56/120)為主，其中，未分化型患者、單純型患者、變異型患者、混合型患者均以CHI2/D10Z1/D17Z1多倍體表達為主，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 FISH技術檢測結果分析

2.5單獨檢測和聯合診斷效能分析 通過對患者的單獨檢測和聯合診斷效能比較，3種方法聯合檢測診斷靈敏度顯著高于單獨檢測，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 單獨檢測和聯合診斷效能分析

3 討 論

CLL疾病是一種惡性淋巴增殖性疾病，多見于老年男性患者[2]，其中以CD5+的B細胞CLL疾病占絕大多數，約占95%[7]。目前，CLL的中位生存期大約為10年[8]，患者的預后隨患者的性別、年齡及體能狀態而各異。對于CLL疾病的診斷，目前臨床多采用骨髓鏡檢方式，骨髓形態學檢查是最為基本的檢查手段之一[9]，骨髓涂片相對簡單，骨髓細胞結構較為清晰，胞質著色較鮮艷，在白血病的分型中普遍使用，但是在對疾病的進展及預后評價中存在一定的缺陷。而骨髓切片活檢，則可以準確預估患者的骨髓增生情況[10]，通過直觀對患者的骨髓造血細胞的分布、定位及數量評價，綜合患者間質水腫及骨小梁改變等情況，觀察骨髓增生異常綜合征的粒系病態，進而對患者的預后狀態進行準確評價。

本研究中，骨髓涂片的檢出率(83.33%)低于骨髓切片(100.00%)，同時通過對患者2種檢測方法的診斷靈敏度分析，骨髓切片的診斷效能顯著高于骨髓涂片，分析認為，在患者的骨髓涂片制作過程中，某些骨髓增生較低患者的取材失敗率較高，患者的骨髓纖維組織也在一定程度上影響患者的取材[11]，而骨髓活檢過程采取環鉆法進行，有效彌補了患者涂片取材過程中的不足[12]，提升患者樣本中低活躍度病變組織，在實際診斷過程中，造成患者的漏診。通過對患者的ROC曲線分析，骨髓切片活檢的診斷靈敏度顯著高于骨髓涂片。楊娣娣等[13]對患者骨髓細胞形態學的涂片和活檢結果對比觀察顯示，骨髓活檢效能顯著高于對照組，與本研究相互印證。

在采用多參數流式細胞術對患者的檢測中，CLL患者的交叉髓系抗原以CD33(33.33%,)居多，在對患者的流式細胞術的檢查中，通過對膜內抗原的檢測，在骨髓形態學檢測中的單純型CLL疾病的診斷，有4例患者被免疫抗原診斷為混合型CLL疾病，證實通過對患者進行流式細胞儀檢測，對患者的形態學診斷具有一定的彌補作用。董蘋等[14]對CLL的診斷中，流式細胞儀檢測對于CLL診斷具有一定的彌補性，與本研究相互印證。

另外，在對患者的核酸物質的檢測中，通過探針原位雜交檢測，患者的核酸變異以CHI2/D10Z1/D17Z1多倍體(46.67%)為主，在56例CHI2/D10Z1/D17Z1多倍體的分析中，40例患者表現為多倍體，8例患者未見分裂象，其余8例患者表現為分裂相，但是無法進行具體分析。通過本研究證實，接近50%的CLL患者均表現為CHI2/D10Z1/D17Z1多倍體變異，在實際患者的診斷和治療過程中，可以通過對CHI2/D10Z1/D17Z1多倍體的變異情況，對患者的治療效果及預后評價具有積極的作用。在對患者的骨髓活檢和流式細胞儀檢測中，有效形成互補，對于患者的個性化治療提供重要依據。

本研究中采用骨髓涂片，通過免疫組織化學檢查，對患者的核酸具有一定的特異性。通過對患者的骨髓活檢，相比傳統的骨髓涂片檢查，對患者的核酸診斷具有顯著的靈敏度。通過對患者的核酸異質性進行精準診斷，對患者的治療方案的選擇具有積極意義。

4 結 論

綜上所述，骨髓活檢對CLL患者的診斷效能較高，同時對患者采用流式細胞儀檢測，可有效對患者的骨髓形態學形成互補，并通過對患者采用FISH技術檢測，可作為患者治療效果監測的重要依據。