精胺氧化酶抑制劑SI-4650抑制人惡性黑素瘤A375細胞增殖的分子機制研究

周游 王艷林 曹春雨 孫麗丹 楊建林

三峽大學醫學院 腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443002

近年研究發現，腫瘤細胞中的總多胺含量顯著高于正常細胞［1］，多胺水平的異常升高促進腫瘤生長和侵襲轉移，而多胺的耗竭則能抑制腫瘤細胞增殖，由此多胺代謝途徑已經成為腫瘤防治和抗癌藥物設計的分子靶點［2-3］。精胺氧化酶（spermine oxidase，SMO）是多胺分解代謝的關鍵酶，以精胺（spermine）為底物，將其氧化為精脒（spermidine），同時生成 3-氨基丙醛和 H2O2［4-5］。研究證實，SMO表達異常導致的多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內的多種疾病的發生發展密切相關［6］。我們前期運用基于藥效團的計算機輔助藥物設計技術和高通量虛擬篩選技術，獲得了一種靶向SMO 的新型小分子抑制劑SI-4650，通過分子和細胞水平實驗證實，SI-4650可通過抑制SMO活性，干擾細胞多胺代謝，誘導人神經膠質瘤U87MG 細胞和骨肉瘤143B 細胞發生凋亡和自噬性死亡［7-8］。惡性黑素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤，具有易早期轉移、致死率高、對化療藥物不敏感等特點。本研究探索SI-4650對人惡性黑素瘤A375細胞增殖和多胺代謝的影響及其可能的分子機制，以期為惡性黑素瘤臨床治療藥物的開發提供新思路。

材料與方法

一、主要試劑與細胞

SI-4650（荷蘭 Specs 公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma 公司）；DMEM 培養基（美國Gibco 公司）；胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；RIPA蛋白裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；自噬小體標記蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體（美國CST 公司）；促凋亡蛋白Bax抗體、凋亡抑制蛋白Bcl-2抗體、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）抗體、自噬相關蛋白Beclin-1抗體（美國Proteintech Group 公司）；β 肌動蛋白抗體（北京科美博瑞科技有限公司）；辣根酶標記二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；熒光標記的LC3 質粒（pEGFP-LC3，美國Add Gene 公司）；ECL超敏顯影液（美國Thermo Scientific 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、FITC-Annexin V 凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；細胞膜熒光探針DIOC6（3）（美國Thermo Fisher 公司）。人惡性黑素瘤A375 細胞購于中國科學院細胞庫（上海），由腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室傳代保存。

二、方法

1.MTT 法檢測 SI-4650 對 A375 細胞增殖的影響：取對數生長期A375細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，每孔1.0 × 103個細胞，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h，同時設未添加細胞的空白培養孔，棄培養基（未特殊說明時為含10%胎牛血清的DMEM 培養基），換用含終濃度為0、10、20、40、80、160 μmol/L SI-4650 的培養基繼續培養，每個藥物濃度設置4 個復孔。分別繼續培養24、48、72 h后，棄培養基，每孔加MTT試劑200 μl（終濃度0.2 g/L），于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育4 h 后，棄MTT 試劑，每孔以 150 μl DMSO 充分溶解，使用酶標儀于490 nm 波長處檢測每孔吸光度（A值）。A375 細胞的生長抑制率 =［1-（實驗組A值 - 空白組A值）/（陰性對照組A值- 空白組A值）］×100%。

2.SI-4650 預處理 A375 細胞：根據 SI-4650 對A375 細胞的生長抑制率篩選SI-4650 處理A375 細胞的時間及濃度。后續實驗使用0（對照組）、40、80 μmol/L SI-4650 處理48 h的A375細胞。

3.化學發光法分析A375 細胞內SMO 的活性：收集上述各組A375細胞，分別以200 μl 0.083 mol/L甘氨酸緩沖液（pH 8.0）浸潤后置于-80 ℃冰箱，于低溫狀態凍融裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min，離心10 min（本文涉及離心時離心半徑均為10 cm），取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。每組樣本取總蛋白含量相同的細胞裂解液，參照文獻［9］配制酶反應體系，以化學發光法檢測蛋白上清液中SMO 的活性，酶活性以單位總蛋白質量（mg）、單位時間（s）內的化學發光強度（RLU）表示。

4.高效液相色譜（HPLC）分析A375 細胞內多胺水平：收集上述各組A375細胞，以800 μl裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。每組樣本取總蛋白含量相同的細胞裂解液，雙蒸水補至800 μl，加入10 μl 苯甲酰氯、20 μl 1 mmol/L DAH（內標分子）、500 μl 2 mol/L NaOH，渦旋 30 s，40 ℃水浴 20 min后，混入2 ml 飽和NaCl 溶液終止反應。采用2 ml乙醚萃取反應液，取上層乙醚液，反復萃取3 次后合并上層乙醚液，通風櫥中揮發至干，1 ml 甲醇溶解標本后，經0.2 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶中，以Waters-e2695 高效液相色譜分析儀分析。色譜分析條件：Luna C18色譜柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm）為固定相，乙腈-水（38∶62）為流動相，流速1 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長設為254 nm，以單位細胞總蛋白（1 mg）中多胺濃度表示相對多胺含量。

5.流式細胞儀檢測A375 細胞周期：收集上述各組 A375 細胞，室溫 1 000 r/min 離心 3 min 后，棄上清液，以1.5 ml預冷75%乙醇重懸細胞，4 ℃固定過夜。室溫1 000 r/min離心5 min后，棄上清液，以1.5 ml 1×PBS洗滌細胞，室溫1000 r/min離心5 min棄上清液。以500 μl結合緩沖液（含0.1%TritonX-100和50 μg/L RNase）重懸細胞后，加入 20 μl 0.5 g/L碘化丙錠（propidium iodide，PI），37 ℃水浴鍋中避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

6.流式細胞儀檢測A375 細胞凋亡：收集上述各組 A375 細胞，室溫 1 000 r/min 離心 3 min 后，棄上清液。以100 μl 結合緩沖液重懸細胞，每樣以5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI混勻后染色，避光條件下25 ℃孵育15 min，再以400 μl 結合緩沖液重懸混勻后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

7.流式細胞儀檢測A375細胞線粒體膜電位情況：收集上述各組A375細胞，無血清DMEM培養液洗滌，室溫1 000 r/min離心3 min后，棄上清液。用無血清DMEM 培養液以2 000∶1 比例稀釋DIOC6（3）母液，取1 ml DIOC6（3）重懸細胞，37 ℃孵育20 min。室溫 1 000 r/min 離心 5 min 后，棄上清液，用1 ml 無血清DMEM 培養液洗滌細胞3 次后，以500 μl 1 × PBS 重懸混勻，流式細胞儀檢測DIOC6（3）探針的綠色熒光。細胞中單體DIOC6（3）綠色熒光強度越高，線粒體膜電位越低。

8.熒光顯微鏡觀察A375 細胞內自噬小體的形成情況：取對數生長期A375 細胞懸液，按1.5 ×105個/孔接種于6 孔板中，培養至細胞融合度約80%時，取2 μg 攜帶綠色熒光蛋白GFP 和外源性LC3 的質粒（pEGFP-LC3 質粒）加入400 μl 無血清DMEM 培養基中混勻，再加入 4 μl TurboFect 轉染試劑，充分混勻并靜置20 min，隨后將上述混合液逐滴加入細胞培養孔中，繼續培養24 h，換用含0（對照組）、40、80 μmol/L SI-4650 的 DMEM 培養基培養48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察自噬小體標記物LC3重組綠色熒光蛋白的胞內聚集情況，分析A375細胞中自噬小體的形成情況。

9.Western印跡法檢測A375細胞凋亡、自噬相關蛋白表達：收集上述各組A375 細胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，BCA 法測定總蛋白濃度。每組樣本取總蛋白質量均為60 μg 的上清液，經電泳、轉膜、封閉后，以對應一抗于4 ℃孵育過夜，再以對應二抗室溫孵育2 h，采用ECL化學發光法顯影并記錄結果，以目的蛋白與內參β 肌動蛋白灰度值之比反映目的蛋白相對水平。

10.統計學方法：采用SPSS 13.0 軟件，計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、SI-4650抑制A375細胞增殖

見圖1。不同濃度SI-4650 及不同處理時間的A375 細胞增殖抑制率差異有統計學意義（F=977.23、5.16，P＜0.05）。SI-4650處理A375細胞48 h，對細胞的IC50 值為（90.48 ± 6.99）μmol/L，各濃度組間細胞增殖抑制率差異有統計學分意義（F=244.16，P＜ 0.05），40、80 μmol/L SI-4650 組抑制率與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.001）。

二、SI-4650對A375細胞內SMO活性、總多胺含量的影響

對照組、40 μmol/L 組、80 μmol/L 組 A375 細胞SMO 的酶活性差異有統計學意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L組活性低于對照組（P＜ 0.01），80 μmol/L組活性低于40 μmol/L 組（P＜ 0.05）。3 組腐胺、精脒、精胺、總多胺含量差異均具有統計學意義（均P＜ 0.001），40、80 μmol/L 組多胺含量均低于對照組（均P＜ 0.01）。見表1。

三、SI-4650對A375細胞周期的影響

對照組、40 μmol/L 組、80 μmol/L 組 A375 細胞G0/G1期、S期、G2/M期比例差異有統計學意義（均P＜ 0.05），40、80 μmol/L 組細胞 G0/G1、G2/M 期細胞比例低于對照組（P＜0.05），S期細胞比例高于對照組（P＜0.01）。見表2。

四、SI-4650對A375細胞凋亡的影響

圖1 MTT法檢測精胺氧化酶抑制劑SI-4650對人惡性黑素瘤A375 細胞增殖的影響 隨著SI-4650 濃度的增加和作用時間的延長，A375細胞抑制率逐漸增加。a：與對照組相比，P ＜0.01。n=4

表1 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細胞精胺氧化酶活性、多胺含量的影響（）

注：n=3。a 與對照組相比，P ＜ 0.001

SI-4650（μmol/L）多胺含量（mg/L） 精胺氧化酶活性（RLU）0（對照組）40 80 F值P值腐胺0.55±0.02 0.32±0.04a 0.25±0.01a 109.30＜0.001精脒1.31±0.01 0.88±0.01a 0.67±0.01a 10029.27＜0.001精胺2.17±0.02 1.97±0.01a 1.88±0.01a 338.02＜0.001總多胺4.03±0.01 3.18±0.03a 2.81±0.01a 2931.07＜0.001 159307.17±9138.16 61432.85±2620.92a 43337.35±1221.25a 242.58＜0.001

表2 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細胞周期、凋亡細胞比例及細胞中單體DIOC6（3）綠色熒光強度的影響（）

表2 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細胞周期、凋亡細胞比例及細胞中單體DIOC6（3）綠色熒光強度的影響（）

注：n=3。與對照組相比，a P ＜ 0.05，b P ＜ 0.01

SI-4650（μmol/L）0（對照組）40 80 F值P值細胞周期比例（%）G0/G1期76.87±2.52 70.68±0.69a 65.78±0.28b 26.74＜0.01 S期15.63±2.48 27.61±2.05b 31.58±1.45b 31.66＜0.001 G2/M期7.50±1.55 3.11±1.56a 2.64±1.18a 6.91＜0.05凋亡細胞比例（%）5.20±0.46 7.59±0.63b 20.14±2.27b 100.68＜0.001 DIOC6（3）熒光強度1 311.67±40.47 2 029.00±56.20b 2 950.67±48.03b 570.22＜0.001

流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、40 μmol/L組、80 μmol/L 組A375細胞凋亡比例差異有統計學意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L 組凋亡比例高于對照組（P＜ 0.05）。單體DIOC6（3）的綠色熒光峰值顯示，3 組細胞熒光強度差異有統計學意義（F=20.73，P＜ 0.01），40、80 μmol/L 組細胞熒光強度高于對照組（P＜ 0.05）。見表2，圖2、3。

Western 印跡法顯示，3 組間促凋亡蛋白Bax、凋亡降解標志蛋白c-PARP、凋亡抑制蛋白Bcl-2水平差異均有統計學意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L組細胞Bax、c-PARP 水平高于對照組（P＜ 0.001，P＜ 0.05），Bcl-2 水平低于對照組（P＜ 0.001）。見表3、圖4。

五、SI-4650對A375細胞自噬的影響

倒置熒光顯微鏡觀察結果示，對照組細胞中熒光蛋白呈彌散性均勻分布，40 μmol/L 組細胞出現斑點狀聚集熒光，80 μmol/L 組細胞聚集熒光斑點更多（圖5A）。Western 印跡法顯示，對照組、40 μmol/L組、80 μmol/L組A375細胞內自噬相關標志蛋白Beclin-1 和自噬微管蛋白LC3-Ⅱ水平差異有統計學意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L 組細胞Beclin-1、LC3-Ⅱ水平均高于對照組（P＜ 0.01）。見圖5B。

圖2 流式細胞儀檢測精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細胞的影響 40、80 μmol/L SI-4650組細胞凋亡比例高于對照組

圖3 流式細胞儀檢測精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）作用于人惡性黑素瘤A375 細胞后單體DIOC6（3）綠色熒光強度 40、80 μmol/L SI-4650組熒光強度高于對照組，提示線粒體膜電位低于對照組

圖4 Western印跡法檢測精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375 細胞凋亡影響 40、80 μmol/L SI-4650 組促凋亡蛋白Bax、凋亡降解標志蛋白c-PARP水平高于對照組，凋亡抑制蛋白Bcl-2水平低于對照組

表3 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細胞凋亡、自噬蛋白水平的影響（）

表3 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細胞凋亡、自噬蛋白水平的影響（）

注：n=3。與對照組相比，a P ＜ 0.01，b P ＜ 0.001

SI-4650（μmol/L）0（對照組）40 80 F值P值凋亡相關蛋白水平自噬相關蛋白Bax 0.32±0.04 0.83±0.12a 1.18±0.16a 35.51＜0.001 Bcl-2 1.03±0.25 0.65±0.09b 0.12±0.002b 27.54＜0.001 Bax/Bcl-2 0.33±0.17 1.28±0.12b 8.98±1.38b 104.85＜0.001 c-PARP 0.18±0.005 0.32±0.002b 0.79±0.035b 730.11＜0.001 Beclin1 0.66±0.006 1.00±0.007a 1.14±0.003b 35.87＜0.001 LC3-Ⅱ0.20±0.001 0.31±0.00002a 0.98±0.003b 425.04＜0.001 LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ12.98±0.005 3.13±0.003b 0.90±0.001b 424.89＜0.001

圖5 精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細胞自噬的影響 5A：倒置熒光顯微鏡下觀察（×1 200），SI-4650 處理轉染了自噬小體標記蛋白LC3熒光質粒的A375細胞后，40 μmol/L組細胞中出現斑點狀聚集熒光，80 μmol/L 組聚集熒光斑點更多；5B：Western 印跡法顯示，40、80 μmol/L SI-4650 組細胞自噬相關標志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ水平高于對照組

討 論

SMO 表達異常導致多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內的多種疾病的病理進程密切相關［2，6］。研究證實，SMO 高表達是導致肺癌、前列腺癌及胃腸道癌癥等惡性腫瘤發生發展的重要誘發因素［10-11］。惡性黑素瘤惡性程度高，預后極差。我們的前期研究設計了一種靶向SMO 的新型小分子抑制劑SI-4650，本文探索了SI-4650 對人惡性黑素瘤A375細胞增殖和多胺代謝的影響。

本研究發現，SI-4650 能有效抑制A375 細胞的增殖，在共培養48 h 條件下的IC50 為90.48 ±6.99 μmol/L，隨SI-4650作用時間延長和劑量增大，抑制效應也隨之增加。并可誘導A375細胞周期阻滯在S期。SMO作為多胺分解代謝的關鍵酶，可以將精胺氧化為精脒，同時產生3-氨基丙醛和H2O2［4-5］。本研究發現，SI-4650能有效抑制A375細胞中SMO 的酶活性，且酶活性隨藥物濃度增加而降低；HPLC分析發現，經SI-4650處理后，SMO酶促反應催化產物精脒含量隨著藥物濃度的增加而逐漸減少，總多胺含量也顯著下降，但SMO催化反應底物精胺含量并未發生相應的升高，可能的原因為SMO酶活性的抑制導致多胺降解代謝受阻，精胺通過精脒/精胺N1 乙?；D移酶（SSAT）的催化轉變為乙?；?，通過腫瘤細胞膜表面高表達的多胺轉運載體直接排出細胞外［12-13］，使得細胞內并未出現精胺的積累。由此證實SI-4650 作為SMO 的抑制劑，有效抑制A375 細胞內的SMO 酶活性，進而影響SMO 催化精胺的轉化，干擾A375 細胞正常的多胺代謝進程，降低細胞內總多胺含量，從而抑制A375細胞的增殖。

本研究發現，SI-4650干預后可使A375細胞凋亡比例升高，同時Western 印跡法顯示，A375 細胞內的促凋亡蛋白Bax表達上調，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調，Bax/Bcl-2 比值顯著升高，細胞內凋亡降解標志蛋白c-PARP水平增高。同時利用熒光染料DiOC6（3）檢測發現，細胞線粒體膜電位顯著降低。提示SI-4650 作用A375 細胞后，可引起Bax、Bcl-2 表達改變導致的跨線粒體膜孔形成，線粒體膜電位下降，膜通透性增加，從而釋放凋亡因子，通過線粒體途徑誘導A375細胞發生凋亡。

細胞凋亡和細胞自噬分別稱為Ⅰ型、Ⅱ型程序性細胞死亡，探究細胞凋亡和自噬在抗腫瘤效應中發揮的作用及其相關分子機制為當前的研究熱點之一。誘導黑素瘤自噬可有效抑制其生長，可能達到治療的目的［14-16］。本研究發現，SI-4650 干預A375細胞后，壞死細胞數量顯著增多，提示SI-4650抑制A375 細胞增殖的機制不僅為誘導細胞凋亡。進一步實驗證實，SI-4650還可誘導A375細胞發生自噬性死亡。本研究采用SI-4650 處理預先轉染LC3 熒光蛋白基因的A375 細胞后，細胞內的熒光信號由彌散狀向斑點聚集狀轉化，提示SI-4650 處理使A375 細胞內LC3 蛋白聚集到了自噬小體上。自噬激活相關蛋白Beclin-1 是形成自噬體的關鍵分子之一，與多種蛋白相互作用共同調控自噬體的形成與成熟；LC3-Ⅱ作為自噬體形成的特異性分子標記物，與自噬小體的數量密切相關，由LC3-Ⅰ在自噬發生過程中轉化而來［17-19］。本研究顯示，SI-4650 干預后A375 細胞中自噬激活相關蛋白Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表達增多，這些結果均提示SI-4650可誘導A375細胞發生自噬性死亡。

綜上，本研究證實，SI-4650具有抑制人惡性黑素瘤A375 細胞增殖的藥理活性，其機制可能與影響細胞周期、干擾細胞內多胺代謝和誘導細胞凋亡以及自噬性死亡相關，提示SI-4650 在人惡性黑素瘤治療及研究中的潛在應用價值。但鑒于黑素瘤的高轉移性和藥物靶向性是腫瘤患者臨床治療的難點之一，因此SI-4650對A375細胞的侵襲遷移以及正常黑素細胞的影響尚需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突