低深度全基因組測序拷貝數變異檢測技術對缺失型X連鎖魚鱗病的檢測效力及意義的分析研究

白周現 陳晨 蘇利沙 徐慧 王聰慧 時盼來 孔祥東

鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心 450000

魚鱗病是一組皮膚角化障礙性疾病，主要表現為四肢伸側或軀干部皮膚干燥、粗糙，伴有菱形或多角形魚鱗狀脫屑，多為遺傳因素所致。X連鎖魚鱗病（X-linked ichthyosis，XLI）由類固醇硫酸酯酶基因（STS）缺失或突變引起，鱗屑顏色深淺不一，深棕色鱗屑患者約占70%，淺灰色鱗屑患者占30%［1］。男性 XLI 發病率為 1/1 300 ～ 1/1 500［2］。85% ～90% XLI 病例為包括 STS 基因在內的Xp22.31 片段缺失型，其余為STS 單基因突變型［3］。一般通過高通量測序、定量PCR（qPCR）及Sanger測序等進行XLI的遺傳診斷。我們通過分析鄭州大學第一附屬醫院2018年所有進行拷貝數變異（copy number variation，CNV）檢測的案例，探討低深度全基因組測序CNV 檢測技術（CNV-Seq）在缺失型XLI遺傳診斷和產前診斷中的應用。

對象與方法

一、研究對象

收集2018全年于鄭州大學第一附屬醫院進行CNV 檢測的 3 616 例受試者，其中孕婦 2 891 例，其他725 例，以及進行魚鱗病單基因檢測的7 例魚鱗病患者或家系的表型資料和遺傳檢測結果。2 891例孕婦產前檢測樣本主要為羊水，部分為胎兒絨毛，極少數為臍血樣本，725例其他受試者檢測樣本為外周血。3 616例受試者中，6例孕婦的胎兒樣本檢出缺失型XLI 陽性，這6 例受試者皆因魚鱗病家族史以外的臨床指征行羊水穿刺CNV檢測。經詢問魚鱗病家族史和臨床表現，6 個家系情況見圖1。本研究獲得鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（批件號：KS-2018-KY-36），受試者簽署知情同意書后進行采樣檢測，胎兒父母驗證實驗采集胎兒父母的外周血進行實驗。

二、方法

1.羊水細胞和外周血DNA 提取：使用純化柱法（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國 QIAGEN 公司）提取羊水細胞基因組DNA。使用磁珠法提取試劑盒（Blood DNA Midi Kit D3494，美國Omega Bio-tek公司）和自動化DNA提取設備（艾本德中國有限公司）抽提外周血基因組DNA。

2.CNV-Seq檢測：使用商品化CNV檢測文庫構建試劑盒（北京貝瑞和康生物技術有限公司），通過本科室Illumina 測序平臺NextSeq 500 檢測CNVs。測序類型SE45（單端測序，讀長45 bp），平均測序深度0.1X。人類基因組參考序列版本選擇GRCh37（UCSC 數據庫，http：//genome.ucsc.edu/cgibin/hgGateway）。采用 Tattini 等［4］的 CNV 檢測算法分析測序數據，檢出CNVs分辨率為100 kb以上。

3.qPCR 法驗證 CNV：以 5 例孕婦羊水、1 例攜帶者母親、1 例健康女性對照的基因組DNA 為模板，采用GeneTool 軟件自行設計的特異引物（表1）和熒光定量試劑盒（KAPA SYBR?FAST Universal kit，美國Kapa Biosystems公司）于QuantStudio5 PCR儀（美國ThermoFisher 公司）對目標序列進行實時定量檢測。STS基因共10個外顯子，選取第1、5、10外顯子代表整個基因。

4.染色體微陣列法驗證CNV：使用Affymetrix平臺Cyto Scan 750k型號芯片獨立驗證檢出的CNV。750k芯片包含兩種設計原理的探針：200 436個單核苷酸多態性（SNPs）探針和550 000個CNV探針，分別采用SNP 微陣列和比較基因組雜交（CGH）微陣列原理。應用配套軟件ChAS-3.2 分析微陣列原始數據。

5.CNV 致病性分析：CNVs 的注釋分析主要參考人群多態性數據庫DGV（database of genomic variants，http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、病例數據庫 DECIPHER（database of genomic variation and phenotype in humans using ensembl resources，https：//decipher.sanger.ac.uk）和人類孟德爾遺傳在線數據庫OMIM（online Mendelian inheritance in man，https：//omim.org）。同時參考基因劑量效應數據庫 ClinGen（clinical genome resource，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbvar/clingen）分析拷貝數缺失、重復的意義。

6.7 例魚鱗病患者或家系的CNV 檢測：對2018 年收集的7 例魚鱗病患者使用魚鱗病基因包（panel）引物混合物（由北京邁基諾基因科技股份有限公司合成）靶向捕獲測序技術，通過本中心Illumina NextSeq 500測序平臺進行高通量測序，人類基因組參考序列版本選擇GRCh37。經基因靶向捕獲測序發現，其中2例為缺失型XLI患者，對這2例患者進行CNV-Seq 檢測以分析染色體片段CNV情況，驗證CNV-Seq檢測技術在該單基因遺傳病中的診斷意義。

結 果

一、CNV-Seq檢測

3 616 例受試者CNV 檢測全部成功，成功率為100%，檢測結果顯示，6 例（1.66‰）Xp22.31 缺失（含STS主效基因），見表2。經家系驗證發現，其中2 例（家系1、2）為自發突變，1 例（家系5）為父源遺傳，3 例（家系3、4、6）為母源遺傳；家系1、2、3、5、6的胎兒羊水Xp22.31缺失結果和家系4孕婦的驗證結果見圖2。

2018 年在我院進行CNV 檢測的3 616 例受試者中發現Xp22.31重復（與Xp22.31缺失相同位置，含STS 主效基因）16 例（4.42‰），包括11 例女性為Xp22.31 三倍重復，5 例男性為 Xp22.31 二倍重復（圖3）。16例Xp22.31重復案例中4例為正常表型成人或兒童，12例為胎兒，其中5例Xp22.31重復胎兒進行了父母來源驗證，結果均遺傳自正常表型父親或母親。

二、qPCR法驗證CNV檢測結果

圖1 6個X連鎖魚鱗病（XLI）家系譜圖 家系5中Ⅲ3為貓叫綜合征患兒；家系1、2只追蹤到2代人，受試者經隨訪否定魚鱗病家族史

表1 定量PCR（qPCR）中類固醇硫酸酯酶（STS）基因外顯子的引物設計

表2 6個X連鎖魚鱗病（XLI）家系Xp22.31缺失拷貝數變異（CNV）檢測結果

圖2 6個X連鎖魚鱗病（XLI）家系致病缺失區域拷貝數變異（CNV）測序結果 A、B、C、D、E分別為家系1（胎兒Ⅱ2）、5（胎兒Ⅲ4）、2（胎兒Ⅱ1）、3（胎兒Ⅲ1）、6（胎兒Ⅳ1）的產前診斷結果，F 為家系4 的孕婦驗證結果，紅色方框內為拷貝數異常區域，其他區域拷貝數正常，顯示Xp22.31片段缺失

圖3 拷貝數變異（CNV）檢測顯示部分受試者存在包含類固醇硫酸酯酶（STS）基因的Xp22.31 片段重復3A：女性受試者；3B：男性受試者，紅色方框內為拷貝數異常區域，其他區域拷貝數正常，顯示Xp22.31片段重復

采用qPCR 法驗證6 例產前CNV 檢測為Xp22.31缺失陽性的結果，顯示家系5 Ⅲ4女性胎兒為STS 基因完全雜合缺失攜帶者，家系1、2、3、4、6中男性胎兒STS基因完全缺失。qPCR結果與CNV測序結果一致，見圖4。

三、染色體微陣列驗證

選取家系5 中Ⅲ4 女性胎兒雜合Xp22.31 缺失攜帶者進行SNP-CGH 染色體微陣列法驗證，Affymetrix 750k 微陣列結果為 arr［hg19］Xp22.31（6 473 896-8 061 665）× 1，與CNV 測序結果一致，見圖5。可知CNV-Seq 技術對CNV 檢測可以達到與傳統芯片技術一樣的效力。

四、CNV致病性分析

圖4 定量PCR 驗證6 例產前拷貝數變異（CNV）檢測診斷Xp22.31 缺失陽性胎兒的類固醇硫酸酯酶（STS）基因缺失情況1 ～ 6分別為家系1（胎兒Ⅱ2）、5（胎兒Ⅲ4）、2（胎兒Ⅱ1）、3（胎兒Ⅲ1）、6（胎兒Ⅳ1）和4（胎兒Ⅲ1）；家系5 Ⅲ4女性胎兒為STS基因完全雜合缺失攜帶者，家系1、2、3、4、6中男性胎兒STS基因完全缺失

本研究檢出的6 例Xp22.31 缺失片段大小從500 kb至1.7 Mb，均含有XLI的STS主效基因，另有若干其他無明確致病意義的OMIM 基因。CNV 人群多態性數據庫DGV（截至2019年7月25日）未收錄Xp22.31缺失案例，病例數據庫DECIPHER（更新至 2018 年 5 月 23 日）收錄了 3 例 Xp22.31 缺失致病的病 例 ，這些 病例（DECIPHER ID：326575，289553，326575）均表現為先天性魚鱗病且致病性明確。本研究檢出的Xp22.31 缺失片段覆蓋DECIPHER收錄的STS缺失型XLI綜合征區域。根據基因劑量效應數據庫ClinGen 記錄，STS 為單倍劑量不足效應（haploinsufficiency）基因，具有足夠的劑量致病性證據（haploinsufficiencyscore 3）。因此，判斷Xp22.31缺失（含STS）為致病性CNV。

本研究同時也檢出16 例Xp22.31 重復，與Xp22.31 缺失位置相同，大小約1.6 Mb。DGV 數據庫未收錄Xp22.31 重復案例，DECIPHER 數據庫亦無類似明確致病的案例收錄。無證據表明STS 為3 倍 劑 量 敏 感 效 應（triplosensitivity）基 因（triplosensitivityscore 0）。16 例 Xp22.31 重復的男性和女性攜帶者均表型正常，經家系驗證的胎兒父母之一攜帶該重復亦表型正常。結合個體表型，分析認為，Xp22.31重復為多態性變異的可能性大。

五、魚鱗病基因突變檢測情況

圖5 單核苷酸多態性-比較基因組雜交染色體微陣列法驗證家系5女性胎兒產前拷貝數變異（CNV）診斷結果 5A：局部放大圖；5B：全局圖。紅色方框內為拷貝數異常區域，其他區域拷貝數正常

2018 年鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心7例魚鱗病患者的魚鱗病基因panel 檢測結果見表3。結果顯示，丑角樣魚鱗病1例，尋常型魚鱗病2 例，XLI 3 例，未找到致病基因突變1 例。對缺失型 XLI 患者 5 和患者 7 行 CNV 測序分析，顯示2例患者均存在基因拷貝數異常，患者5的Xp22.31（6 480 000-7 860 000）存在1.38 Mb半合子缺失（含STS基因），患者7的Xp22.31（6 820 000-7 720 000）存在0.9 Mb半合子缺失（含STS基因），見圖6。

討 論

通常情況下對魚鱗病的遺傳診斷采用皮膚病相關基因panel，通過靶向捕獲高通量測序法進行致病基因突變篩查［6］。2015 年有研究者［7］通過CNV-Seq 法檢測到母體X 染色體Xp22.31 片段（含STS 基因）拷貝數異常與無創產前DNA 檢測技術（NIPT）檢測到的胎兒性染色體非整倍體假陽性有關。我們通過對本中心CNV 檢測結果中含STS 基因Xp22.31 片段缺失陽性案例的整理，探討CNVSeq 檢測技術對STS 缺失型XLI 的診斷適用性和意義。

本中心2018 年3 616 例進行CNV 檢測的受試者中，共檢出6例Xp22.31片段缺失陽性，其中男性胎兒5例、女性胎兒1例。CNV檢測發現的6個XLI家系，皆因無魚鱗病在內的臨床指征不適合作單基因病遺傳診斷，而行產前篩查或診斷，經電話隨訪獲知家系5 和家系6 有魚鱗病家族史，其余4 個家系均否認家族史。經分子生物學實驗驗證，家系1和家系2 為胎兒自發突變，其余4 個家系為親代遺傳。其中家系5 因貓叫綜合征患兒生育史而做產前診斷，該胎兒經CNV 檢測排除貓叫綜合征患病可能性，意外發現為魚鱗病Xp22.31片段缺失攜帶者。這6 個XLI 家系胎兒，其中4 例因無創檢測提示X 染色體異常可能而行羊水穿刺產前診斷，另2 例因其他不良生育史或唐氏篩查高風險而行產前診斷。CNV-Seq 檢出的XLI陽性結果與qPCR和SNP-CGH微陣列2種方法獨立驗證結果一致，這與以往研究［8］認為全基因組測序法檢測拷貝數異常的可靠性符合。此外，在這3 616例行CNV檢測的受試者中，我們發現Xp22.31 重復（含STS 基因）攜帶率4.42‰，綜合分析認為，該片段重復為多態性變異。因此，CNV-Seq 檢測技術可應用于缺失型XLI的基因診斷及產前診斷，并且該技術能夠同時對全基因組范圍內的拷貝數異常進行篩查。

本中心2018 年7 例因魚鱗病進行遺傳學診斷的案例中，有 3 例 STS 基因突變致 XLI，其中 2 例為STS完全缺失型。在這7例魚鱗病患者中，我們發現了3 例新發候選致病性變異，其中患者1 為引產胎兒，外院根據臨床表現診斷為魚鱗病，本中心檢測到高度相關的ABCA12基因c.490delA（p.I164Ffs*8）移碼突變和39-42 號外顯子缺失組合的復合雜合突變，依據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）指南［9］，判斷為致病性變異（等級PVS1），但該突變的致病性仍需進一步的功能驗證或家系攜帶驗證。患者4 為絲聚合蛋白（FLG）基因c.10969C＞T（p.R3657X）和c.3321delA（p.G1109Efs*13）［5］復合雜合突變導致的尋常型魚鱗病，其中p.R3657X 無義突變為新發變異且具致病性（等級PVS1）；患者6存在 STS 基因 c.923A＞G（p.Y308C）錯義突變導致XLI 的可能性。應用CNV-Seq 技術對STS 缺失型XLI 患者進行遺傳診斷得到的結果與基因Panel 測序法一致。

表3 2018年鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心7例魚鱗病患者基因診斷概況

圖6 缺失型X連鎖魚鱗病（XLI）患者5和患者7拷貝數變異（CNV）測序 紅色方框內為拷貝數異常區域，其他區域拷貝數正常，患者5和7存在Xp22.31片段缺失

XLI 是一種較為常見的皮膚角化障礙性疾病，STS缺失型為該病的主要致病形式。缺失型XLI具有臨床表現異質性，魚鱗病皮損表現從輕微到嚴重程度不一，極少數可能會合并其他全身癥狀。缺失型XLI 的產前基因檢測能夠對該病在胎兒期進行及早診斷，但由于該病的臨床表現異質性和遺傳異質性，相關遺傳咨詢需謹慎。對有遺傳家族史的胎兒可結合家系內患者表型綜合分析，對新發突變的受檢胎兒應對孕婦進行充分的風險告知。

總之，本研究探討了CNV-Seq檢測技術在缺失型XLI 的基因診斷及產前診斷中應用的可靠性以及檢出情況。報告了新的單中心XLI相關Xp22.31片段缺失的人群頻率（1.66‰）和相同位置的Xp22.31 片段重復的人群頻率（4.42‰），綜合分析認為Xp22.31片段重復為多態性變異。CNV-Seq技術能夠穩定、可靠、快捷地檢出缺失型XLI變異，為XLI的診斷及遺傳咨詢提供了新途徑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突