他克莫司對人角質形成細胞蛋白酶活化受體2表達及功能的影響

王上上 倪春雅 鄒穎 李巍 徐金華

復旦大學附屬華山醫院皮膚科，上海 200040

蛋白酶活化受體2（protease activated receptor 2，PAR-2）廣泛分布于人體內各組織和細胞，可被多種內外源性絲氨酸蛋白酶激活，產生多種生物效應。PAR-2 在皮膚組織尤其是炎癥性皮損的多種細胞（包括角質形成細胞、真皮血管內皮細胞、免疫細胞等）中均有顯著表達，提示其可能參與皮膚炎癥和免疫反應［1］。他克莫司是一種大環內酯類免疫抑制劑，其外用制劑已廣泛應用于皮膚科各個領域，并且發現外用他克莫司可降低銀屑病及特應性皮炎患者皮損中PAR-2 的表達［2-3］，但其對人角質形成細胞PAR-2 表達及功能的影響目前尚缺乏體外實驗證實。我們應用不同濃度他克莫司與人角質形成細胞共培養，觀察PAR-2 mRNA和蛋白表達的變化及其對PAR-2 激動劑所引起的鈣離子動員的影響。

材料與方法

一、材料

人角質形成細胞來源于華山醫院泌尿外科21例16 ～30歲男性包皮環切術后組織，該研究已通過復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準（批件號2017-400），取材前患者或家屬均簽署知情同意書。二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），腔室玻片系統（美國Thermo Fisher Scientific公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；DMEM培養基、胎牛血清產自美國HyClone 公司，反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒產自日本Takara 公司；PAR-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Trizol、Fluo-4鈣檢測試劑盒產自美國Invitrogen 公司，他克莫司凍干粉（分析純，純度99.9%）、胰蛋白酶產自美國Sigma 公司，鼠抗人PAR-2 單克隆抗體（PAR-2msIgG）、山羊抗小鼠IgG 產自美國Santa Cruz公司。

二、方法

1.細胞培養及處理：采用胰蛋白酶消化法分離表皮，在37 ℃、5%CO2條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養人角質形成細胞，以每孔105個細胞接種于無菌有蓋24孔板。細胞生長達70%融合時給予無血清DMEM培養基同步化24 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養基，加入不同濃度（分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，用二甲基亞砜稀釋）他克莫司共培養，以未加他克莫司組作為對照組，繼續培養24 h后收集細胞，進行后續實驗。

2.半定量反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測人角質形成細胞PAR-2 mRNA 的表達：Trizol 法提取經上述處理的人角質形成細胞RNA，逆轉錄合成cDNA，取cDNA行PCR反應。設計引物序列，PAR-2 上游引物 5′-GGCACCATCCAAGGAACCA-3′，下游引物 5′-CTGTTTCAACTGTAACTCCTTTTC CA-3′；GAPDH 上游引物 5′-CCACTCCTCCACCTTT GAC-3′，下游引物5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。PCR 反應體系 25 μl，反應條件為 94 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共40 個循環。反應結束后，取5 μl PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，拍照，ImageJ 軟件分析目的基因片段的灰度值與相應GAPDH 灰度值，以其比值表示PAR-2 mRNA表達水平。

3.Western印跡檢測人角質形成細胞PAR-2蛋白的表達：使用蛋白裂解液將經上述處理的人角質形成細胞裂解后收集上清液，用BCA 法定量，調整蛋白濃度。應用半干轉法轉膜，使用0.45 μm孔徑聚偏氟乙烯膜，恒流200 mA轉膜1.5 h，轉膜后用麗春紅染色試劑對膜染色；加針對PAR-2的鼠抗人抗體，4 ℃孵育過夜后，加辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG 室溫孵育1 h，ECL 發光法檢測反應條帶。以β肌動蛋白為內參，凝膠成像系統觀察拍攝電泳凝膠成像照片，ImageJ 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與β肌動蛋白的灰度比值表示蛋白表達水平。

4.免疫熒光檢測人角質形成細胞PAR-2 的表達：24 孔板內鋪圓形蓋玻片，接種人角質形成細胞，生長融合達50%時，無血清培養24 h，與不同濃度（0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）他克莫司分別共培養24 h 后棄培養基，制備細胞爬片，加入一抗PAR-2 msIgG孵育，4 ℃過夜，加入二抗異硫氰酸熒光素標記山羊抗小鼠IgG 孵育，沖洗后用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察PAR-2的表達，每標本取5個獨立高倍視野測量PAR-2的平均吸光度（A值），取均值。

5.Fluo-4 檢測他克莫司對PAR-2 激動劑引起的人角質形成細胞內鈣離子動員的影響：將人角質形成細胞接種于腔室玻片系統，生長融合達50%時，無血清培養24 h，與不同濃度（0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）他克莫司分別共培養24 h；每孔加入含Fluo-4 的染色液，37 ℃孵育30 min，室溫孵育30 min。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，選擇488 nm氬激光為激發波長，設定各項參數，記錄背景熒光；加入PAR-2激動劑胰蛋白酶，激光掃描共聚焦顯微鏡下動態掃描細胞內熒光強度變化，每5 秒記錄1次，測量100 s，Olympus Fluoview 系統軟件記錄和數據化細胞的熒光強度圖像和曲線。

6.數據處理和統計分析：采用SPSS 14 統計軟件，方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析比較組間人角質形成細胞PAR-2表達和細胞內鈣離子濃度，不同組別與對照組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、PAR-2在人角質形成細胞中的表達

免疫熒光染色顯示，PAR-2在人角質形成細胞中呈中低水平表達，位于細胞膜和細胞質，呈顆粒狀均質分布（圖1）。

二、他克莫司對人角質形成細胞PAR-2 mRNA表達的影響

半定量RT-PCR 檢測顯示，各濃度他克莫司組與對照組間PAR-2 mRNA 表達水平差異有統計學意義（F= 18.99，P＜ 0.001）；與對照組相比，10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 他克莫司組表達水平均顯著下降（t值分別為2.93、3.28、4.41、4.85、10.48，P＜0.05 或 0.01）。PAR-2 mRNA 表達水平與他克莫司濃度呈負相關（r=-0.962，P=0.009）。見圖2。

三、他克莫司對人角質形成細胞PAR-2蛋白表達的影響

Western印跡檢測顯示，共培養24 h后，各濃度他克莫司組人角質形成細胞與對照組間PAR-2 蛋白表達水平差異有統計學意義（F= 5.672，P=0.001）。與對照組相比，10-5和10-6mol/L他克莫司組PAR-2蛋白水平顯著下降，t值分別為3.149、3.255，P值分別為0.014、0.012，而10-9、10-8、10-7mol/L他克莫司組下降不顯著（t值分別為0.518、0.907、0.499，P值分別為0.618、0.391、0.631）。見圖3。

免疫熒光法分析結果顯示，人角質形成細胞與不同濃度他克莫司共培養24 h后，各組間PAR-2蛋白的表達差異有統計學意義（F= 2.851，P=0.037）。與對照組比較，10-5、10-6和10-7mol/L 他克莫司組PAR-2 表達水平顯著下降（t值分別為3.217、2.542、2.587，P值 分 別 為 0.012、0.035、0.032），10-9和 10-8mol/L 他克莫司組無明顯變化（t值分別為0.870、1.647，P值分別為0.409、0.138）。見圖4。

圖1 免疫熒光檢測人角質形成細胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）表達 PAR-2 表達于胞膜和胞質，呈顆粒狀均質分布（× 600）DAPI：4′，6-二脒基-2-苯基吲哚

圖2 半定量RT-PCR檢測人角質形成細胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）mRNA的表達 2A： RT-PCR產物電泳結果；2B：各組PAR-2 mRNA相對表達水平統計比較。M：DNA標準參照物；1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L他克莫司組。與對照組比較，a：P ＜ 0.05，b：P ＜ 0.01，c：P ＜ 0.001

圖3 Western印跡檢測人角質形成細胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）蛋白表達 3A：Western印跡圖譜；3B：各組PAR-2相對表達水平統計比較。1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L他克莫司組。與對照組比較，a：P ＜ 0.05

圖4 免疫熒光半定量檢測人角質形成細胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）的表達 4A：免疫熒光染色圖（×400）；4B：各組PAR-2平均光密度值比較。1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L他克莫司組。a：與對照組（未加他克莫司組）比較，P ＜ 0.05

圖5 胰蛋白酶刺激后人角質形成細胞內鈣離子動員情況 激光掃描共聚焦顯微鏡（×400）下觀察發現，加入胰蛋白酶后，細胞內鈣離子濃度迅速升高，30 ～45 s達到峰值

四、他克莫司對人角質形成細胞PAR-2活化引起的細胞內鈣離子動員的影響

激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察發現在角質形成細胞中加入胰蛋白酶后，細胞內鈣離子濃度一過性增高，胰蛋白酶引起細胞內鈣離子動員的達峰時間是30 ～ 45 s（圖5）。

與不同濃度的他克莫司共培養24 h后，角質形成細胞中胰蛋白酶引起的細胞內鈣離子動員的達峰時間均為30 ～45 s，且鈣離子濃度在90 s時明顯下降，各組間在上升速度、達峰時間和下降速度方面無明顯區別。各組間細胞內鈣離子峰濃度比較差異有統計學意義（F= 4.953，P= 0.003）；與對照組比較，10-5、10-6和 10-7mol/L 他克莫司組鈣離子動員的峰濃度顯著降低（t值分別為2.582、2.821、2.923，P值分別為0.032、0.022、0.019），10-8和10-9mol/L 他克莫司組無明顯變化（t值分別為0.846、0.462，P值分別為0.422、0.657）。見圖6。

圖6 他克莫司對胰蛋白酶引起的細胞內 鈣離子動員的影響1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 他克莫司組。a：與對照組比較，P ＜ 0.05

討 論

PAR-2是蛋白酶激活受體家族中的一員，屬于典型的G蛋白偶聯受體，具有七次跨膜結構和獨特的激活方式，廣泛分布于人體內各組織和細胞（包括皮膚），參與皮膚感染、瘙癢和腫瘤等多個病理生理過程［4］。PAR-2激活后可引起各種細胞因子如白細胞介素6、8和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及趨化因子的分泌和釋放［5］，調節皮膚的免疫應答和炎癥反應。實驗誘導的過敏性和刺激性接觸性皮炎的炎癥反應在PAR-2 基因敲除小鼠中均明顯減弱，提示PAR-2 在皮膚炎癥過程中發揮重要作用［6］。角質形成細胞和真皮血管內皮細胞是PAR-2的主要效應細胞［7］，在炎癥性皮膚病如特應性皮炎和銀屑病皮損中，角質形成細胞和血管內皮細胞PAR-2 表達均顯著增加［2-3］。所以，角質形成細胞PAR-2 的前炎癥效應可能作為治療皮膚炎癥的一個新靶位。

他克莫司的作用機制與環孢素相似，均通過抑制細胞增殖的信號轉導通路來發揮作用。他克莫司的主要靶細胞是淋巴細胞，通過抑制早期淋巴細胞相關基因的表達，抑制淋巴細胞的免疫活性［8］。除了淋巴細胞，他克莫司還可直接作用于特應性皮炎樣皮損中的角質形成細胞，促進轉化生長因子β釋放，下調可誘導性一氧化氮合酶mRNA和蛋白表達，并通過調節核因子κB 來抑制角質形成細胞分泌腫瘤壞死因子α［9］。

本研究顯示，體外培養的角質形成細胞與一定濃度的他克莫司共培養后，PAR-2 mRNA和蛋白表達均受到抑制，其中10-9mol/L 他克莫司即可使PAR-2 mRNA表達顯著降低，而PAR-2蛋白的表達下降在他克莫司濃度＞10-7mol/L 時才有統計學意義，表明他克莫司對PAR-2 mRNA 的抑制更顯著。出現這一現象的原因可能是他克莫司主要通過與FKBP12蛋白結合抑制轉錄因子活化T細胞核因子（NFAT）而發揮作用，它所阻斷的主要是轉錄過程，但基因的轉錄和翻譯發生的時間和位點存在時空間隔，基因在轉錄后，還要經歷轉錄后加工和轉錄產物降解、翻譯以及翻譯后加工及修飾等，因此導致他克莫司對PAR-2基因轉錄水平和翻譯水平影響并不完全一致的現象。由此推測他克莫司可能通過抑制PAR-2 基因的表達來抑制PAR-2 在細胞表面的表達，不過他克莫司影響PAR-2基因表達的信號轉導通路尚需進一步明確。

鈣離子作為第二信使在細胞中廣泛參與各種生命活動，多種炎癥因子的分泌及表達均需要鈣離子參與。PAR-2 激動劑胰蛋白酶可識別并裂解PAR-2的N末端的特殊部位，引發細胞內鈣離子動員，使細胞內鈣離子濃度一過性升高［10］。因此細胞內鈣離子動員可以作為PAR-2活化的一項指標，用以衡量PAR-2的功能。本研究顯示，胰蛋白酶能引起人角質形成細胞內鈣離子濃度一過性升高，其達峰濃度受他克莫司的影響，他克莫司濃度＞10-7mol/L時峰值鈣離子濃度顯著降低，而對于細胞內鈣離子動員的上升速度、達峰時間和下降速度則無影響。由于角質形成細胞中PAR-2 蛋白表達水平亦表現出與他克莫司濃度的相關性，即當他克莫司濃度大于10-7mol/L 時才出現PAR-2 蛋白表達的下降，所以他克莫司對人角質形成細胞PAR-2 活化引起的Ca2+峰值濃度的變化與PAR-2 表達量的變化具有一致性，提示他克莫司可能并不影響蛋白酶激活PAR-2 的過程，PAR-2 整體功能的下降可能是由PAR-2表達量的下降引起。

綜上所述，本研究結果表明，他克莫司可抑制角質形成細胞PAR-2的功能性表達，可能通過抑制PAR-2基因的表達來實現，推測外用他克莫司可能通過直接抑制皮膚角質形成細胞PAR-2 的表達來治療炎癥性皮膚病。但是，本研究主要為體外實驗，他克莫司在體內炎癥狀態下發揮的具體作用還有待進一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突