城市大氣細顆粒物PM2.5對人角質形成細胞屏障相關蛋白表達的影響

姚騏羽 羅陽 姚煦 劉軍

1昆明醫科大學影像醫學系 650500；2中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院過敏與風濕免疫科，南京 210042；3南京大學醫學院附屬鼓樓醫院皮膚科 210008

已有研究［1-4］證實，大氣懸浮顆粒物（PM）顯著增加心血管疾病、呼吸道疾病和神經毒性的風險。PM2.5是大氣中直徑≤2.5 μm的懸浮顆粒，由于其穿透性強，易于富集有毒金屬元素而具危害性［5］。皮膚直接與外界環境接觸，受到PM2.5 的影響［6］。已有研究［7］顯示，PM2.5作用于角質形成細胞后，會引起皮膚屏障蛋白和炎癥分子表達增高，其中的重金屬發揮了重要作用。不同地區PM2.5中重金屬組分不同，目前我國尚無空氣污染物中PM2.5對皮膚屏障蛋白表達的影響研究。本研究分析上海市空氣污染物中PM2.5 重金屬組分的同時，研究PM2.5 對皮膚屏障蛋白和前炎癥細胞因子表達的影響。

材料與方法

1.材料與試劑：PM2.5樣本由復旦大學兒科醫院周玉峰教授惠贈。RT-PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑及RIPA裂解液（江蘇碧云天生物技術研究所）；CCK8試劑盒（美國MedChem Express公司），ELISA檢測試劑盒（北京達科為生物技術有限公司）。小鼠抗人β肌動蛋白（美國Cell Signaling Technology公司），小鼠抗人絲聚蛋白、兔抗人角蛋白14、兔抗人緊密連接蛋白1（美國Biolegend公司）。限制性角質形成細胞無血清培養基（defined keratinocyte-FSM，KC-FSM，美國Invitrogen life公司）。

2.原代角質形成細胞培養：在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院取5 例包皮環切術后的包皮放置于含有青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后剪碎，置于分散酶Ⅱ中4 ℃消化過夜。分離真表皮，表皮用含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶于孵箱內37 ℃消化10 min，含血清培養基終止消化，200 目濾網過濾，制備單細胞懸液。取約3×105細胞放入細胞培養瓶中，并加入KC-FSM培養基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中穩定培養。培養液約每2 ～3天更換1 次。該研究經中國醫學科學院皮膚病醫院倫理委員批準，倫理審批號為2018快審第（KY001）號，患者均簽署知情同意書。

3.細胞活性檢測：角質形成細胞穩定培養傳代后，將細胞接種于 96 孔板中，每孔 200 μl，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，待細胞生長至80%時進行以下實驗。向細胞中加入0（對照組）、10、50、100和200 mg/L PM2.5，培養24 h后檢測生存率，確定PM2.5 的最佳作用濃度。50 mg/L PM2.5 處理原代角質形成細胞0、3、6、9、12、18和24 h，以只加培養基的孔作為對照組，確定PM2.5 的最佳作用時間。每組實驗設5 個復孔。處理結束時更換培養基，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37 ℃孵箱培育1 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度（A值），細胞存活率=［（A實驗-A空白）/（A對照-A空白）］×100%。

4.角質形成細胞釋放細胞因子的檢測：按上述不同濃度PM2.5刺激角質形成細胞24 h后，收集細胞培養上清液，ELISA 法檢測上清液中白細胞介素1α（IL-1α）、胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）、IL-33的表達。

5.皮膚屏障蛋白mRNA和蛋白表達的檢測：用TRIZOL 法和RIPA 法分別抽提上述不同濃度PM2.5 組處理24 h 時角質形成細胞的總RNA 和總蛋白質。紫外分光光度計測定RNA 濃度，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。熒光定量PCR 檢測皮膚屏障蛋白絲聚蛋白、緊密連接蛋白1及角蛋白14 mRNA表達，PCR 引物序列見表 1，mRNA 檢測結果用2-△△Ct表示，其中 Ct 為循環值。△△Ct = 實驗組（Ct目的基因- Ctβ肌動蛋白）- 對照 組（Ct目的基因-Ctβ肌動蛋白）。Western 印跡法分析屏障蛋白的變化，以肌動蛋白做內參，用BandScan 軟件分析膠片目的基因/內參的相對灰度值。

結 果

1.PM2.5 對角質形成細胞活力的影響：CCK8法檢測細胞活力顯示，與對照組相比，10 mg/L PM2.5組角質形成細胞存活率無明顯變化（LSD-t=0.18，P＞ 0.05），50、100、200 mg/L PM2.5 組細胞存活率均顯著下降（LSD-t= 0.21、0.26、0.09，均P＜0.05）。見表2。

50 mg/L PM2.5 處理角質形成細胞不同時間的實驗中，隨著PM2.5 作用時間延長，生存率逐漸降低，與對照組相比，均P＜0.05。最初的3 h 內細胞死亡較快，6 h之后，細胞生存率開始穩定在一定水平，24 h 時細胞生存率為72.37% ± 3.12%。見表2。孵育時間選取24 h用于后續實驗。

2.PM2.5 對皮膚屏障蛋白mRNA 和蛋白表達的影響：穩定傳代的原代角質形成細胞經PM2.5刺激24 h 后，熒光定量PCR 結果見表3。不同濃度PM2.5 組絲聚蛋白mRNA 表達不同（P＜ 0.01）；與對照組相比，10 mg/L 和50 mg/L PM2.5組表達升高（LSD-t= 0.12、0.41，均P＜ 0.05），100 mg/L 和200 mg/L PM2.5 組表達下降（LSD-t=0.77、0.25，均P＜ 0.05）。此外，除10 和50 mg/L PM2.5 組間差異無統計學意義（P=0.095）外，其余各PM2.5組間差異均有統計學意義（P＜ 0.01）。

角蛋白14 mRNA 表達亦先上升后下降，差異有統計學意義（P＜ 0.01），10、50、100、200 mg/L PM2.5組與對照組相比差異均有統計學意義（LSD-t= 0.45、0.48、0.49、0.48，均P＜ 0.05）。除10 mg/L與 50 mg/L PM2.5 組及 100 mg/L 與 200 mg/L PM2.5組差異無統計學意義（P= 0.15、0.095），其余各PM2.5組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。

各組緊密連接蛋白1 mRNA 表達差異有統計學意義（P＜ 0.01），10、50、100、200 mg/L PM2.5 組均顯著低于對照組（LSD-t=0.20、0.03、0.065、0.33，P＜ 0.05）。除 10 mg/L 與100、200 mg/L PM2.5 組比較差異無統計學意義（P=0.57、0.16），其余PM2.5組間差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 皮膚屏障蛋白引物序列及產物大小

Western 印跡法顯示，不同濃度PM2.5 組絲聚蛋白、角蛋白14、緊密連接蛋白1 水平差異均有統計學意義（P＜ 0.01）。50、100 mg/L PM2.5 組絲聚蛋白表達高于對照組（LSD-t= 0.58、1.12，均P＜0.05），而10、200 mg/L PM2.5 組與對照組差異無統計學意義（LSD-t=0.002、0.45，P=0.95、0.053）。各PM2.5 組角蛋白14 的表達均高于對照組（LSD-t=0.42、1.24、1.04、1.30，均P＜ 0.05）。10 mg/L PM2.5組緊密連接蛋白1 表達與對照組差異無統計學意義（LSD-t=-0.02，P= 0.87），50、100、200 mg/LPM2.5組均高于對照組（LSD-t=0.22、0.27、0.54，均P＜ 0.05）。見圖1、表3。

表2 原代角質形成細胞經不同濃度PM2.5處理24 h及50 mg/L PM2.5處理不同時間對細胞生存率的影響（）

表2 原代角質形成細胞經不同濃度PM2.5處理24 h及50 mg/L PM2.5處理不同時間對細胞生存率的影響（）

注：n=5。a 與對照組相比，P ＜ 0.05

PM2.5濃度0（對照組）10 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L F值P值細胞存活率（%）100.00±1.16 94.15±2.14 75.89±2.65a 71.80±3.21a 67.43±1.79a 96.703＜0.05 PM2.5作用時間0（對照組）3 h 6 h 9 h 12 h 18 24細胞存活率（%）100.00±1.03 86.24±2.04a 82.02±2.24a 79.32±2.58a 75.23±1.86a 73.89±2.04a 72.37±3.12a

3.PM2.5 對角質形成細胞前炎癥因子表達的影響：不同濃度PM2.5 刺激24 h 后，角質形成細胞分泌TSLP、IL-1α 和IL-33 水平均明顯升高（圖2）。各組TSLP 水平差異有統計學意義（F= 20.85，P＜0.01），10、50、100、200 mg/L PM2.5組均高于對照組（LSD-t= 48.83、55.90、75.83、131.73，均P＜ 0.01）。除10 mg/L與100、200 mg/L PM2.5組差異有統計學意義（均P＜ 0.01），其余各PM2.5 組間差異均無統計學意義（均P＞ 0.05）。

圖1 Western印跡法檢測不同濃度PM2.5處理角質形成細胞24 h對皮膚屏障蛋白表達的影響 絲聚蛋白的蛋白表達先升高后下降；各組角蛋白14 的蛋白表達均有一定升高，50 mg/L PM2.5 組角蛋白14表達水平最高；緊密連接蛋白1的蛋白表達略升高

表3 不同濃度PM2.5處理原代角質形成細胞24 h后絲聚蛋白、角蛋白14和緊密連接蛋白1 mRNA和蛋白表達水平（）

表3 不同濃度PM2.5處理原代角質形成細胞24 h后絲聚蛋白、角蛋白14和緊密連接蛋白1 mRNA和蛋白表達水平（）

注：n=3。mRNA為2-△△Ct值，蛋白表達為目的基因/肌動蛋白相對灰度值比值。a 與對照組相比，P ＜0.05

PM2.5濃度0（對照組）10 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L F值P值絲聚蛋白mRNA表達1 1.27±0.15a 1.32±0.09a 0.84±0.11a 0.42±0.12a 56.47＜0.01蛋白表達1 0.99±0.15 1.61±0.18a 2.11±0.34a 1.45±0.23 23.46＜0.01角蛋白14 mRNA表達1 1.15±0.13a 1.08±0.16a 0.67±0.09a 0.74±0.11a 41.71＜0.01蛋白表達1 1.40±0.23a 2.25±0.38a 2.01±0.31a 2.30±0.41a 10.13＜0.01緊密連接蛋白1 mRNA表達1 0.67±0.20a 0.87±0.13a 0.72±0.12a 0.62±0.10a 28.44＜0.01蛋白表達1 0.92±0.19 1.21±0.17a 1.27±0.21a 1.53±0.22a 52.43＜0.01

圖2 不同濃度PM2.5 對角質形成細胞前炎癥因子白細胞介素1α（IL-1α）、胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）、IL-33 表達的影響 隨著PM2.5濃度升高，角質形成細胞分泌的TSLP、IL-1α和IL-33均升高

各組IL-1α水平差異有統計學意義（F=11.23，P＜ 0.01）。50、100、200 mg/L PM2.5 組顯著高于對照組（LSD-t= 58.93、90.7、108.23，均P＜ 0.01），而10 mg/L PM2.5 組與對照組差異無統計學意義（LSD-t=41.4，P=0.06）。10 mg/L PM2.5組與100、200 mg/L PM2.5 組差異有統計學意義（均P＜0.01），其余各PM2.5 組間差異均無統計學意義（均P＞ 0.05）。

各組IL-33 水平差異亦有統計學意義（F=48.87，P＜ 0.01），且各PM2.5 組均顯著高于對照組（LSD-t=7.73、17.17、20.20、31.83，均P＜ 0.01）。50與100 mg/L PM2.5 組間差異無統計學意義（P=0.25），其余各PM2.5 組間差異均有統計學意義（均P＜ 0.01）。

PM2.5濃度與前炎癥因子TSLP、IL-1α和IL-33分泌量均呈正相關（r= 0.57、0.67 和 0.91，均P＜0.05）。

討 論

完整的皮膚屏障是抵御外界不良因素侵擾的第一道防線，其功能主要依靠角質層。角質形成細胞中與結構功能相關的蛋白包括絲聚蛋白、角蛋白14、緊密連接蛋白1等［8-9］。PM2.5表面存在的有害物質（包括重金屬）可能會滲入皮膚，對包括角質形成細胞在內的活細胞有直接損傷作用［10］。Kim等［11］進行了PM2.5 對角質形成細胞轉錄組影響的研究，發現PM2.5 可誘導細胞壓力相關系統、細胞因子和炎癥分子、S100A蛋白、皮膚屏障蛋白、基質金屬蛋白酶類等表達異常，其中皮膚屏障相關蛋白表達的異常主要表現為絲聚蛋白、內披蛋白、轉谷氨酰胺酶3 等表達升高，及角蛋白10 和15 表達降低，而細胞因子和炎癥分子表達的異常主要表現為IL-1β、IL-1α、IL-36 和趨化因子 14 等表達升高。PM2.5的水溶液中主要是各種重金屬離子，不同國家和地區的大氣污染物中重金屬離子組分不同，其對皮膚屏障功能的影響不完全一致。我們采集了上海市城區大氣污染物中PM2.5，重金屬組分依次為Fe、Mg、Zn、Pb、Ca、Mn 等，與上述文獻報道差異較大。

本研究發現，暴露于PM2.5不僅可降低角質形成細胞生存率，還可導致皮膚屏障有關蛋白絲聚蛋白、角蛋白14和緊密連接蛋白1的表達異常。既往研究［7］發現，僅在PM2.5濃度為100 mg/L時，絲聚蛋白的表達增加有統計學意義。我們的研究發現，在PM2.5 較低濃度時絲聚蛋白和角蛋白14 的表達增加，而在PM2.5 高濃度時其表達降低，這可能與高濃度PM2.5 使細胞活性下降有關。本研究結果提示，在低濃度PM2.5暴露下角質形成細胞中絲聚蛋白和角蛋白14表達增加，保持皮膚屏障完整性，增加皮膚滲透功能，進而起到修復皮膚屏障的作用［12］；當PM2.5 濃度持續升高，角質形成細胞存活率大大下降，皮膚屏障蛋白表達也隨細胞活性的下降而下降。緊密連接蛋白1 是皮膚屏障的重要組成部分，本研究發現，緊密連接蛋白1 的表達水平亦隨著PM2.5濃度的增加先升高后下降，提示高濃度PM2.5破壞了細胞之間的連接，進一步破壞了皮膚屏障的完整性。本研究還發現，PM2.5可以刺激角質形成細胞分泌前炎癥細胞因子TSLP、IL-1α和IL-33，這三種細胞因子均是過敏性皮膚病（如特應性皮炎）局部皮膚炎癥中重要的細胞因子，參與過敏原經皮致敏、皮膚屏障功能受損和異常T細胞免疫應答等多種生物學過程［13-14］。本研究中，高濃度PM2.5 誘導的皮膚屏障蛋白表達降低可能與這些前炎癥因子表達升高相關。

綜上所述，PM2.5對皮膚屏障功能產生重要影響，推測當皮膚角質形成細胞暴露于PM2.5水溶液時，首先發生前炎癥細胞因子和皮膚屏障相關蛋白表達的應激性升高；但當PM2.5濃度升高到一定程度后，角質形成細胞出現活性下降，進而引起皮膚屏障相關蛋白表達降低，在炎癥因子的協同作用下誘導經皮免疫的發生，加劇皮膚屏障受損的惡性循環。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突