咪喹莫特長期刺激誘發小鼠銀屑病樣皮損及骨丟失

王玉丹 卑明健 張蘭 邵李濤 張燕飛 田發明 李政霄

1華北理工大學醫學實驗研究中心，河北唐山 063000；2西安交通大學第二附屬醫院皮膚病院 710000

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性疾病，除皮膚損害外，銀屑病病程的長短與骨質疏松呈正相關［1］。一項對美國成年人7 年的隨訪研究顯示，銀屑病患者發生骨質減少、骨質疏松、骨軟化、強直性脊柱炎和病理性骨折的概率明顯升高［2］。然而，目前尚缺乏銀屑病伴相關骨丟失的動物模型，這也在一定程度上阻礙了相關防治措施和治療方案的進一步研究。

目前多采用咪喹莫特乳膏局部涂藥1 周左右［3-5］誘導構建銀屑病模型，然而短期應用咪喹莫特并不能造成骨量的改變，因此無法用于銀屑病合并骨丟失的研究。我們擬通過長期應用咪喹莫特刺激小鼠背部，觀察其能否在誘導皮膚炎癥的同時，造成骨量丟失和微觀結構改變，以期建立相關動物模型，為相關后續研究奠定基礎。

材料與方法

一、材料

5%咪喹莫特乳膏（商品名艾達樂），來自英國3M Health Care Limited 公司，批號H20160079。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、破骨細胞分化因子（receptor activator of nuclear factor kappa-β ligand，RANKL）抗體來自北京博奧森生物技術有限公司。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素17（IL-17）ELISA 檢測試劑盒來自上海鑫樂生物科技有限公司。OPG、RANKL 基因引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。微計算機斷層掃描（微CT）儀（比利時SkyScan 公司），生物力學機（日本SHIMADZU公司）。

二、方法

1.動物分組及處理：12 只 10 周齡 20 ～ 25 g SPF 級健康雌性昆明小鼠產自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號SCXK（京）2014-0004，動物實驗許可證號SYXK（冀）2015-0038。小鼠分籠飼養，每籠6只，飼養室室溫21 ～23 ℃，濕度30%～40%。小鼠自由進食飲水，每日更換高壓消毒后的干燥無菌墊料，實驗期間禁用一切與實驗無關的藥劑和物品。所有實驗行為均依據動物實驗倫理委員會制定的動物福利和倫理標準操作。將12 只小鼠適應性飼養1 周后，按照隨機數字表法隨機分為兩組，每組6 只，提前1 d 將背部剃除約2 cm×3 cm區域的毛發，因咪喹莫特乳膏誘導銀屑病模型的常用劑量為 62.5 mg［6］和 50 mg［7］，予實驗組小鼠背部每日涂抹50 mg咪喹莫特乳膏，對照組同部位每日涂抹等體積凡士林軟膏，每日觀察背部皮膚表現，10周后處死小鼠，處死前觀察小鼠皮膚紅斑、鱗屑及皮損增厚情況，測量體重并于麻醉后取眼球血，處死后取背部皮損組織，蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察組織學改變；取小鼠脛骨進行微CT 測定脛骨近端松質骨骨量及微觀結構；取小鼠股骨做三點彎曲實驗，檢測其生物力學性能。

2.大體觀察：記錄小鼠背部紅斑、鱗屑、肥厚等銀屑病的特征性表現，計算銀屑病面積和嚴重程度指數（PASI）評分。小鼠PASI 評分標準：對皮膚紅斑、鱗屑、肥厚3個方面進行評分，每種表現按嚴重程度由低到高分為5個等級：無皮損為0分，皮損輕度為1分，中度為2 分，重度為3分，極重度為4分。

3.HE 染色及組織學觀察：將小鼠背部皮損標本固定、脫水、石蠟包埋、切片，HE 染色后光鏡下觀察。

4.免疫組化染色：取小鼠左側脛骨近端骨組織標本常規固定、脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋，制成6 μm厚切片，經烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水、抗原修復后，分別滴入OPG 和RANKL 一抗孵育過夜，第2 天孵育二抗，經二氨基聯苯胺顯色后，再進行復染、鹽酸分化，最后脫水、中性樹膠封片。光鏡下觀察脛骨近端松質骨OPG 和RANKL 表達情況并采集圖像，用Image-Pro Plus 6.0對圖像量化分析。

5.微CT 掃描：取小鼠左側脛骨，應用微CT 掃描，工作條件為40 keV，250 μA，掃描完成后，應用配套軟件對掃描圖像進行三維重建及結果分析。對生長板下1 mm 松質骨進行分析，指標包括骨小梁體積比、骨小梁厚度、骨小梁數量（生長板下1 mm松質骨中骨組織與非骨組織交點數量的平均值）、骨小梁分離度（生長板下骨小梁之間髓腔平均寬度）、骨小梁連接密度（生長板下每立方毫米體積中骨小梁網狀結構之間的連接數量）。

6.生物力學分析：取小鼠左側股骨進行三點彎曲試驗，支點跨距（L）為8 mm，以股骨后面向下、內側髁和外側髁同時接觸底座為標準確定標本位置，中央垂直（股骨與載荷成90°角）施加載荷，速率5 mm/min，直至股骨斷裂，記錄并分析最大壓縮載荷及彈性模量。

7.血清TNF-α、IL-17水平分析：參照試劑盒說明，ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-17的水平。

8.實時 PCR 檢測 OPG 和 RANKL mRNA 的表達：取右側脛骨組織研碎后，按Trizol試劑盒說明書提取RNA，經反轉錄合成第一鏈cDNA 后，進行實時熒光定量PCR，以3-磷酸-甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因作為內參照。引物序列：OPG 正向引物5′-GGCCTTCTTCAGGTTTGCTGTTCC-3′，反向引 物 5′-GCAGGTCTTTCTCGTTCTCTCAATC-3′；RANKL 正向引物 5′-GATGGAAGGCTCATGGTTGG ATGT-3′，反向引物5′-CGAAAGCAAATGTTGGCGT ACAGG-3′。PCR 反應體系：總體積 50 μl，包括實時 PCR MasterMix 25 μl，cDNA 模板 5 μl，引物（10 μmol/L）各2 μl。OPG和RANKL PCR反應條件相同，即95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，69 ℃ 30 s，45個循環；72 ℃5 min。以目的基因和內參照基因相對表達量的比值表示目的基因的表達量。實驗重復3次。

9.統計學方法：采用SPSS 23.0 進行統計學處理。獨立樣本t檢驗比較分析兩組指標間差異。P＜0.05表示差異有統計學意義。

副詞作為一個成員龐雜的詞類，其成員分類也較為復雜，但對否定副詞的定義和歸類學界觀點一致，否定副詞就是表示否定意義的一類，在句子中修飾謂語。根據否定副詞內部語義功能的不同，將其分為四類：一般性否定、己然性否定、判斷性否定、祈使性否定[2]。各否定副詞在兩文獻中所占的比例如表1所示：

結 果

一、銀屑病小鼠模型的建立

實驗組小鼠用藥3 ～4 d 后背部皮膚開始出現紅斑及少許鱗屑，5 ～7 d 后出現浸潤性斑塊，表面鱗屑增多，刮屑后可見點狀出血現象；8 ～10 d時皮膚紅斑加重，浸潤增厚明顯，隨后鱗屑略有減少并穩定在一定水平；第10 周時，紅斑范圍擴大，皮損增厚甚至出現皸裂。見圖1。

10周后，對照組PASI評分為0，實驗組PASI評分為9.167± 1.722，兩組間差異有統計學意義（t=13.31，P＜ 0.001）。

二、小鼠體重比較

實驗前，對照組小鼠體重（24.84 ± 1.04）g，實驗組為（24.98 ± 1.72）g，兩組差異無統計學意義（t=-0.16，P=0.881）。誘導10 周后，對照組小鼠體重為（32.22±1.43）g，實驗組為（27.10±1.85）g，實驗組顯著低于對照組（t=4.89，P=0.001）。

三、組織學改變

HE 染色顯示，對照組小鼠皮膚正常。實驗組小鼠表皮棘層肥厚，表皮突延長，真皮淺層炎癥細胞浸潤，海綿水腫，血管擴張，充血明顯，并可見毛囊增多。見圖2。

圖1 銀屑病樣小鼠皮膚表現 1A：對照組小鼠皮膚正常；1B：實驗組（銀屑病樣模型組）小鼠皮膚出現紅斑、鱗屑、增厚 圖2 銀屑病樣小鼠皮膚組織病理（圖中標尺=100 μm） 2A：對照組皮膚未見異常；2B：實驗組（銀屑病樣模型組）小鼠表皮棘層肥厚，表皮突延長，真皮淺層炎癥細胞浸潤，血管擴張，充血明顯

四、OPG、RANKL表達比較

OPG、RANKL 于脛骨近端松質骨中表達。免疫組化染色顯示，對照組OPG 和RANKL 表達水平分別為3 307.00 ± 1 158.72、13 644.67 ± 4 764.61，實驗組分別為 16 021.33 ± 1 954.61、35 433.33 ±1 197.95，兩組間差異均有統計學意義（t值分別為9.692、7.682，均P＜ 0.01）。見圖3。

五、微CT檢測結果

實驗組脛骨近端松質骨骨小梁體積比、骨小梁厚度均顯著低于對照組（P＜ 0.01 或 ＜ 0.05），骨小梁分離度顯著高于對照組（P＜0.05）,但骨小梁數量和骨小梁連接密度差異無統計學意義（均P＞0.05）。見圖4、表1。

六、生物力學檢測結果

三點彎曲實驗檢測顯示，實驗組小鼠彈性模量和斷裂能量與對照組差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

七、ELISA檢測結果

實驗組小鼠血清中TNF-α、IL-17 水平與對照組差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 免疫組化染色檢測銀屑病樣小鼠模型脛骨中骨保護素（OPG）、破骨細胞分化因子（RANKL）的表達（圖中標尺 = 50 μm）實驗組OPG、RANKL表達水平均顯著高于對照組

圖4 銀屑病樣小鼠模型脛骨近端松質骨微計算機斷層掃描重建圖（圖中標尺=1 μm） 實驗組（4B）骨小梁體積比和骨小梁厚度均顯著低于對照組（4A）

表1 微計算機斷層掃描分析銀屑病樣小鼠模型骨量和微結構（）

表1 微計算機斷層掃描分析銀屑病樣小鼠模型骨量和微結構（）

組別對照組實驗組t值P值只數6 6骨小梁體積比（%）0.18±0.016 0.14±0.015 4.065 0.002骨小梁數量（1/mm）6.07±0.35 5.79±0.43 1.234 0.245骨小梁厚度（μm）42.17±3.29 36.92±4.10 2.443 0.035骨小梁連接密度（1/mm3）261.68±11.96 248.60±16.99 1.542 0.154骨小梁分離度（μm）152.39±6.14 165.44±10.07 2.709 0.022

表2 銀屑病樣小鼠彈性模量、斷裂能量和血清TNF-α、IL-17及骨組織中OPG mRNA及RANKL mRNA表達水平比較（）

表2 銀屑病樣小鼠彈性模量、斷裂能量和血清TNF-α、IL-17及骨組織中OPG mRNA及RANKL mRNA表達水平比較（）

注：TNF-α，腫瘤壞死因子α；IL-17，白細胞介素17；OPG，骨保護素；RANKL，破骨細胞分化因子

組別對照組實驗組t值P值只數6 6彈性模量（MPa）49.8±5.57 45.0±5.56 0.746 0.166斷裂能量（N.mm）97.4±10.19 91.6±8.62 0.965 0.306 TNF-α（ng/L）2.369±0.242 2.568±0.316 1.227 0.248 IL-17（ng/L）4.147±0.559 4.661±0.323 1.949 0.080 OPG mRNA 0.101±0.024 0.139±0.017 3.110 0.011 RANKL mRNA 0.223±0.067 0.365±0.076 3.403 0.007

八、實時PCR檢測結果

實驗組小鼠OPG和RANKL mRNA表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。見表2。

討 論

雖然目前尚存爭議，但大多數研究證實銀屑病可合并骨丟失［6-7］。為建立銀屑病合并骨丟失相關模型，我們連續10 周給予小鼠局部咪喹莫特刺激后，發現小鼠在表現出銀屑病表型的同時，松質骨骨量減少，微觀結構發生退變。這為銀屑病合并骨質減少乃至骨質疏松等相關骨丟失疾病提供了動物模型，為研究該疾病相關防治措施及進一步改進治療方案提供依據。

咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠模型是目前應用最為廣泛的動物模型，一般7 d 左右即可成模。我們經過長期刺激發現，該方法可使小鼠皮膚長期處于慢性炎癥狀態，包括典型的鱗屑、紅斑、增厚等表現，以及棘層增厚、炎癥細胞浸潤、血管增生等典型組織學改變。同時，對小鼠脛骨松質骨骨量和微結構分析發現，小鼠并發了骨量下降和微結構的退變。我們曾發現，合并銀屑病性關節炎的患者往往因為活動受限而發生骨丟失［7］。此外，銀屑病和骨丟失有著共同的炎癥介質，包括TNF-α和IL-17，兩者既參與銀屑病的發生發展［8-9］，又在骨質疏松發病機制中扮演重要角色［10］，其中IL-17 是銀屑病誘發骨丟失的重要介質［11］，過表達IL-17 的小鼠表現出銀屑病性關節炎、皮膚損害及骨丟失［12］。進一步研究發現，針對IL-17 的抗體也具有治療兩種疾病的潛在作用［13-14］。本研究中，ELISA 檢測結果雖然提示TNF-α 和IL-17 在實驗組小鼠有升高趨勢，但與對照組相比，差異并無統計學意義，其原因有待進一步深入研究。

此外，雖然本研究顯示，小鼠模型的脛骨近端松質骨骨量下降和微觀結構退變，但生物力學性能與對照組無顯著差異，可能因為皮質骨在股骨抗壓中占據主導地位，僅松質骨發生改變尚不足以顯著改變其抗壓性能。另外，臨床研究顯示，雖然銀屑病患者骨密度有所降低，但是骨折發生的風險并未顯著增加［6］。這也在臨床水平支持我們的推測，即當骨量丟失尤其是松質骨骨量丟失的程度較輕時，丟失的松質骨骨量不足以造成力學性能的顯著退變。

OPG 和RANKL 是骨代謝調控相關因子，OPG可通過拮抗RANKL對抗破骨細胞分化的刺激作用而抑制骨吸收，進而發揮骨保護作用。以往研究顯示，兩者在很多影響骨代謝的慢性炎癥性疾病中表達異常，并且是介導免疫細胞與骨代謝功能細胞相互作用的重要媒介［15-17］。研究證實RANKL 有促進破骨細胞在銀屑病關節炎和骨質疏松骨折中骨吸收的作用［18］，并且銀屑病骨質疏松風險增加主要與持續的慢性炎癥過程有關［19］。本研究中，我們通過免疫組化染色和 PCR 檢測發現，OPG 和 RANKL 在實驗組小鼠均顯著高于對照組小鼠，提示該模型小鼠骨形成和骨吸收均有所增加。實驗組血清TNF-α和IL-17表現出升高趨勢，可能是OPG和RANKL高表達的潛在刺激因素。有研究表明，IL-17A可以通過促進RANKL和巨噬細胞集落刺激因子表達激活破骨細胞形成，促進骨丟失［20-21］。而TNF通過促進單核細胞破骨細胞分化因子受體表達從而將單核細胞轉化為破骨細胞前體細胞，并可以上調成骨細胞譜系細胞RANKL的表達［22］。而在TNF及TNF受體1（P55）敲除小鼠中，卵巢切除后并未出現骨丟失［23］。TNF 及 IL-17 等促炎癥細胞因子與 RANKL在破骨細胞增殖分化中具有協同作用，并且以IL-23/IL-17 為軸心的免疫反饋系統與T 細胞密切相關。活化的T 細胞釋放RANKL，更好地揭示了炎癥性骨病和骨丟失的發病機制［24］。結合上述研究結果及皮膚表現，我們推測，皮膚炎癥刺激導致小鼠體內炎癥反應，相關炎癥介質進一步刺激免疫細胞釋放相關因子，在參與皮膚損害發生發展的同時，對骨代謝也產生一定的影響，并首先刺激RANKL 介導的破骨細胞骨吸收活性，進而誘發機體保護性產生更多OPG，但由于骨吸收活性大于骨形成，最終導致骨量丟失。故我們推測咪喹莫特長期刺激導致的慢性炎癥及活化的免疫細胞與RANKL 間的反饋環路是誘發骨丟失的重要環節和主要機制。

綜上，我們通過咪喹莫特長期局部刺激小鼠皮膚，在造成小鼠銀屑病樣皮損表現的同時，也導致其骨代謝狀態的改變，并最終造成松質骨骨量丟失。因此，背部皮膚長期接受咪喹莫特刺激的昆明小鼠可以作為銀屑病合并骨丟失相關研究的動物模型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突