高效液相色譜法檢測金線蓮中核苷類成分

吳萍萍， 黃麗英

金線蓮為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是一種珍稀名貴藥材，在民間享有“藥王”、“金草”等盛譽。金線蓮性涼，味甘，微苦，具有清熱涼血、袪風利濕、強心利尿、固腎，平肝、止痛鎮咳等功效。金線蓮全草皆可入藥，在東南亞及我國民間廣泛用于治療肝炎、高血壓病、腫瘤、腎炎、糖尿病、小兒驚風高熱等癥[1-3]。近年來的研究表明，金線蓮中含有多種化學成分，如黃酮類、核苷類、多糖類、生物堿、氨基酸、酯類、甾醇、三萜類、微量元素等物質[4-7]，但迄今為止，關于金線蓮中核苷類成分的研究較少。

核苷類化合物作為中藥材中的基礎類物質之一，可以直接或間接作為藥物使用，在抗病毒、抗腫瘤方面展示了不可取代的獨特作用，備受研究者重視。現代藥理學研究表明，核苷類成分具有保護機體組織和器官、調節免疫功能、抗癌等多種藥理作用[8-9]。本研究對不同產地、不同種類、不同生長方式的金線蓮中的胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷6種核苷類物質進行定性分析和含量測定，研究不同金線蓮中各核苷類物質含量的差異，為金線蓮的質量評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材 分別來自福建省內的金線蓮，編號為A，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K及L，其中按照種植方式可以分為組培、種植、野生3類。金線蓮由福建醫科大學天然藥物化學學系張永紅教授鑒別。金線蓮樣本材料的相關信息見表1。

表1金線蓮樣本材料的相關信息

Tab 1The relevant information about tested samples ofAnoectochilusRoxburghii

樣本編號產地種植方式樣本種類A漳州南靖組培4月紅霞B漳州南靖種植5月紅霞C漳州南靖組培5月紅霞D漳州南靖種植12月紅霞E三明永安組培4月紅霞F三明永安種植5月紅霞G福清種植5月紅霞H福清種植6月紅霞I三明永安種植6月紅霞J三明永安野生有金色葉脈K三明永安野生無金色葉脈L三明永安野生有金色葉脈

A～L:為金線蓮不同樣本編號.

1.1.2試劑 胞嘧啶核苷(99%，Lot#L1628034)、鳥嘌呤(98%，Lot#E1605104)、腺嘌呤(99%，Lot#C1727002)、次黃嘌呤(99%，Lot#H1603061)、胸腺嘧啶(98%，Lot#H1605062)、β-胸苷(99%，Lot#H1601064)對照品均購于阿拉丁公司；甲醇、三乙胺、乙酸銨(分析純)均購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為自制雙蒸水。

1.1.3儀器 液相色譜質譜聯用儀(LCMS-2020型，日本Shimadzu公司)；高效液相色譜儀(LC-15C型,日本SHIMADZU公司)；Agilent TC-C18(5 μm，4.6×250 mm)色譜柱(美國Agilent公司)；高速多功能粉碎機(XY-500A型,浙江省永康市松青五金廠)；醫用數控超聲清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；高速冷凍離心機(Neofuge 18R型，力康發展有限公司)；旋轉蒸發儀(RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2方法

1.2.1色譜分離條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相：A-0.05%乙酸銨水溶液，B-甲醇，二元高壓梯度洗脫程序：0～5 min，1% B；5～10 min，1%～5% B，10～30 min，25% B。流速：0.8 mL/min，檢測波長：260 nm，進樣量：20 μL，柱溫：30 ℃。

1.2.2質譜條件 電噴霧離子源(Electron Spray Ionization, ESI)，掃描模式正離子ESI(+)，霧化氣流速：1.5 L/min，干燥氣流速：10 L/min，加熱塊溫度：400 ℃，進樣量：10 μL，掃描范圍m/z：50～800。

1.2.3混合對照品溶液的配制 分別精密稱取胞苷12.6 mg、次黃嘌呤12.1 mg、鳥嘌呤5.2 mg、胸腺嘧啶6.2 mg、腺嘌呤5.6 mg、胸苷8.4 mg置于25 mL量瓶中，加適量的0.1%氫氧化鈉水溶液溶解混勻，定容至刻度，配制成含胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷的濃度分別為504，484，208，248，224，336 μg/mL的混合對照品溶液，置于4 ℃的冰箱內待用。

1.2.4藥材供試品的制備 取金線蓮粉末(過80目篩)約1.0 g，精密稱定，置于超聲-微波協同萃取儀容器中，精密加入0.1%氫氧化鈉水溶液20 mL，于超聲-微波協同萃取儀50 ℃恒溫條件下提取45 min，萃取2次，合并兩次萃取液，減壓旋轉蒸發得浸膏，用少量水溶解定容于25 mL量瓶中， 0.45 μm微孔濾膜濾過，即為得到的供試品溶液。

2 結 果

2.1線性范圍的考察 對“1.2.3”中配制的混合對照品溶液進行1/5，1/10，1/25，1/50 ，1/125，1/250，1/500 濃度稀釋，得到7個不同濃度的混合對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，按“1.2.1”項下色譜條件進行分析測定。取線性范圍內最低濃度混合對照品溶液不斷等倍稀釋進行分析，以信噪比S/N=3作為檢出限(limit of detection, LOD)，S/N=10作為定量限(limit of quantitation, LOQ)，結果見表2。

表2 線性回歸方程、相關系數

LOD:檢出限; LOQ:定量限.

2.2HPLC鑒定金線蓮中核苷類物質 由混合對照品溶液和金線蓮供試品溶液色譜圖(圖1，2)可知，胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤的保留時間分別是5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min。根據保留時間，圖2的1，2，3，4，5，6號色譜峰初步鑒定為胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷。

2.3LC-ESI(+)/MS鑒定金線蓮中核苷類物質 為進一步確認這些色譜峰的歸屬，必須考察對應化合物在相同條件下的結構信息。在設定的HPLC-ESI(+)/MS條件下，分別對胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷的對照品和供試品溶液進樣，經色譜分離后對保留時間分別是5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min色譜峰進行質譜分析，得到各離子峰的精確質量數，6個核苷類成分的質譜特征碎片峰歸屬見表3。

1：胞苷；2：次黃嘌呤；3：鳥嘌呤；4：胸腺嘧啶；5：腺嘌呤；6：胸苷.圖1 混合對照品的高效液相色譜圖Fig 1 Chromatography of standard sample

1：胞苷；2：次黃嘌呤；3：鳥嘌呤；4：胸腺嘧啶；5：腺嘌呤；6：胸苷.圖2 供試品高效液相色譜圖Fig 2 Chromatography of sample

Tab 3The belonging of secondary mass spectrum of six nucleosdies

準分子特征化合物[M+H]+碎片峰歸屬m/zm/z胞苷244.2111.8[M+H-rib]+94.6[M+H-rib-NH3]+68.5[M+H-rib-NH3-CN]+次黃嘌呤137.1119[M+H-H2O]+110[M+H-HCN]+鳥嘌呤152.2135.1[M+H-H2O]+109.9[M+H-NH2CN]+胸腺嘧啶127.1110[M+H-NH3]+84[M+H-NH3-CN]+腺嘌呤136.1119[M+H-NH3]+91.9[M+H-NH3-HCN]+64.8[M+H-NH3-HCN-HCN]+胸苷243.2127.1[M+H-rib]+99[M+H-rib-CO]+

m/z:質子數/電荷數的比值.

基于m/z值、結合各成分在色譜中出峰時間、對照品和文獻數據進行比較和分析，保留時間為5.39，6.76，8.23，9.60，14.31和14.92 min處的色譜峰對應的物質分別鑒定為胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷。

2.4精密度實驗 選取同一濃度的混合對照品溶液，按照“1.2.1”中色譜條件，連續進樣6針，測定各成分的相應信號并計算其RSD值。胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的RSD值(n=6)分別為1.74%，1.97%，1.67%，1.06%，1.89%，1.37%，結果表明儀器精密度良好。

2.5穩定性實驗 取同一供試品溶液分別于0，2，4，6，8，12，24 h進樣，測定胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的含量并計算RSD值分別為1.42%，1.31%，1.25%，1.14%，1.27%及1.84%，說明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.6重復性實驗 取A金線蓮粉末(過80目篩)，每份1 g，分別精密稱定6份。按照“1.2.4”方法制備6份供試品溶液，按“1.2.1”中色譜條件進樣，測定胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胸苷的含量并計算RSD值，結果分別為1.61%，0.62%，0.69%，0.82%，1.32%及0.75%，表明本法重復性良好。

2.7加樣回收實驗 取A金線蓮粉末(過80目篩)9份，每份約0.5 g，精密稱定。分別按照80%，100%，120%濃度水平加入對應量的對照品溶液，按“1.2.4”中的方法制備9份供試品溶液，按“1.2.1”中色譜條件進樣，計算樣本的加樣回收率，結果如表4所示。

2.8樣品含量測定 將12種金線蓮分別精密稱量3份，按照“1.2.4”中制備方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”中液相色譜條件進樣分析測定，測得6種核苷成分在各樣本中的平均含量(表5)。

3 討 論

本研究考察了分別以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸、甲醇-乙酸銨水溶液為流動相時6種核苷成分的分離效果，其中單純以甲醇-水、乙腈-水為流動相時，色譜峰峰形較差；當有機相為乙腈時，目標色譜峰出峰較快，難以與其他雜質峰分離，因此有機相選用甲醇。選用甲醇-乙酸作為流動相時，腺嘌呤和胸苷色譜峰嚴重拖尾；選定甲醇-乙酸銨水溶液作為流動相時，各色譜峰得到較好的分離。

在進行供試品溶液的制備時，本研究考察了甲醇-水、乙醇-水、純水3種提取溶劑的不同比例的溶劑對核苷及堿基類成分提取的影響。結果表明，甲醇及乙醇提取核苷類的成分含量低，色譜峰較少，無法真實有效地反映出金線蓮中含有的核苷類成分的含量。由于鳥嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤對照品在純水中的溶解度較差，易溶于堿性溶液，所以提取溶劑也嘗試了不同pH的溶劑，包括水、0.1%氨水、1%氨水、0.1%氫氧化鈉水溶液、0.1%乙酸、1%乙酸等；提取效果順序為0.1%氫氧化鈉水溶液、0.1%氨水、1%氨水、0.1%乙酸、1%乙酸，結果表明0.1%氫氧化鈉水溶液作為提取溶劑，各核苷類成分測得的含量較高，故最終采用0.1%氫氧化鈉水溶液作為提取溶劑。

表4 回收率實驗結果

RSD：相對標準偏差.

表5 6種成分在各樣本中平均含量

n=3. A～L為金線蓮不同樣本編號.

12種金線蓮樣本經測定均含有胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胸苷6種成分，但各成分的含量差異較大。鳥嘌呤和腺嘌呤在各金線蓮樣本中含量整體較為均衡。以生長方式分類時，總核苷的含量由高到低順序依次為:組培>種植>野生，可能因為組培金線蓮的人工生長環境優越、營養更加豐富，使得金線蓮代謝更加迅速，有利于核苷類成分在藥材中的累積。以產地分類時，不同產地的總核苷的含量沒有較大的差異，幾種金線蓮樣本均來自福建省，各種栽培管理技術以及生長環境都相對類似，因此核苷的總量并沒有顯示較大的差異。

本研究采用LC-MS法分析金線蓮中6種核苷類成分，建立HPLC-UV法測定金線蓮中6種核苷類成分的含量，能夠為金線蓮品質評價和藥效作用的深入研究以及質量標準的進一步完善提供參考。