小麥種子萌發耐高銨脅迫的基因型差異

劉 揚,梁智慧,孫淑珍,田中偉,戴廷波

(1.南京農業大學農學院/農業部作物生理生態與生產管理重點實驗室/江蘇省現代作物生產協同創新中心,江蘇南京 210095; 2.石河子大學農學院/新疆兵團綠洲生態農業重點開放實驗室,新疆石河子 832000;3.江蘇省淮安市淮安區農業技術推廣中心,江蘇淮安 223200)

傳統評定作物品種抗逆性的方法多以產量為標準，但其周期較長，受環境影響較大。萌發期是作物生長發育的基礎階段，也是產量形成的關鍵時期。在萌發和萌發后苗期室內鑒定品種的抗逆性差異不僅可以有效控制外界環境因素，還具有時間短，容量大，重復性強等優點。本研究擬通過水培試驗方法，篩選適宜的小麥種子萌發高銨脅迫臨界濃度，并在此基礎上系統評價不同小麥品種對高銨脅迫響應的差異，為小麥耐高銨基因型的篩選及其生化機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

1.1.1 高銨脅迫臨界濃度的篩選

1.1.2 高銨脅迫臨界濃度點驗證

1.1.3 抗高銨脅迫品種的篩選

以篩選的高銨脅迫臨界濃度于2013年9月和11月進行耐高銨品種篩選試驗。供試材料為不同年代育成的24個小麥品種，包括：南大2419、火燒頭、小偃4號、江東門、豐產3號、揚麥1號、豫麥13、寧麥13、揚麥13、寧麥9號、煙農19、豫麥49、鄭麥9023、揚麥11、揚麥158、鎮麥9523、蘇麥6號、徐州25、魯麥15、矮抗58、淮麥25、金禾9123、揚麥16 。水培容器為塑料紗網特制的培養周轉箱(310×210×110 mm)，選取籽粒飽滿、均勻的小麥種子，用20% H2O2浸泡10 min，蒸餾水沖洗干凈后，置于距周轉箱底部6 cm紗網上，于光暗比12 h/12 h(24/16 ℃)培養。分別用850 mL含篩選的高銨脅迫臨界濃度和對照(CON)的Hoagland營養液進行培養，其離子成分與1.1.1相同。每個處理設4個重復，每天更換一次營養液，并用1.0 mM NaOH調pH至 6.8～7.0。處理7 d后取樣，測定形態指標。

1.2 測試項目與方法

1.2.1 植株形態及干重測定

處理7 d后，取20顆發芽的種子，分別測定胚根和胚芽鞘長度后，將其分為胚芽鞘、根系和種子剩余物三部分，105 ℃殺青30 min，70 ℃ 烘干至恒重，計算不同部位的干物質量。

1.2.2 主要貯藏物質含量和α-淀粉酶活性測定

稱取1.2.1中烘干樣品0.1 g，加8.0 mL 80% 的乙醇于10 mL離心管中，搖勻；80 ℃ 水浴30 min，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于25 mL容量瓶中，乙醇提取重復3次，定容至25 mL；可溶性糖含量采用蒽酮法[12]測定；游離氨基酸含量采用Moore方法[13]測定；總淀粉含量和α-淀粉酶活性分別采用茚三酮比色法[14]和3,5-二硝基水楊酸法[15]測定。

1.3 數據分析

采用耐銨指數[16]衡量不同基因型的耐高銨性。

耐銨指數 = 高銨脅迫下的測定值/硝處理下的測定值。

數據采用EXCEL和SPSS 10.0進行分析；圖表采用Sigmaplot 10.0繪制。

2 結果與分析

2.1 小麥高銨脅迫臨界濃度的篩選

隨著銨濃度的升高，種子發芽率、胚根長度、根數、株高、胚芽鞘和胚根干重逐漸下降(表1)。與CON相比，銨濃度 <5.0 mM各處理的種子發芽率、株高和胚芽鞘干重雖下降，但無顯著性差異；銨濃度>5.0 mM各處理的被測指標均與CON差異顯著。因此，確定高銨脅迫臨界濃度為5.0 mM。由表2可知，與CON相比，5.0 mM銨脅迫下，株高和胚芽鞘干重降低幅度遠小于胚根長度和干重降低幅度，說明根系對高銨脅迫更敏感。

表1 不同銨濃度處理對小麥種子萌發的形態學影響

同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different small letters following data in same column mean significant difference among treatments at 0.05 level.The same in tables 2 and 5.

表2 高銨脅迫對小麥種子萌發的形態學影響

2.2 高銨脅迫對小麥萌發相關生理指標的影響

隨著萌發時間的延長，銨脅迫與CON處理揚麥13萌發種子內α-淀粉酶活性趨勢不盡相同，前3 d均上升且處理間差異不顯著；萌發3 d后，高銨脅迫較CON處理顯著降低了揚麥13萌發種子內α-淀粉酶活性。隨著萌發時間的推進，萌發種子內淀粉含量逐漸下降，在萌發3 d后，高銨脅迫處理的種子內淀粉含量顯著高于CON處理。種子內可溶性糖隨萌發時間推移呈先升后降趨勢，在第5天和第7天時，處理間差異達到顯著水平，游離氨基酸含量隨著萌發時間的推進逐漸增加，在萌發第7天時差異顯著(圖1)。

* 表示兩種處理間在P<0.05水平差異顯著。

* means significant difference between treatments at 0.05 level.

圖1 高銨脅迫對小麥種子萌發貯藏物質動員的影響

Fig.1 Effect of elevated ammonium nutrition on storage matter mobilization during wheat seed germination

2.3 高銨脅迫對小麥萌發相關形態指標的影響

由表3可知，銨脅迫與CON處理間，6個形態指標的差異均達到極顯著水平。兩種氮形態下，胚根干重、胚芽鞘干重、植株干重和根冠比均具有較大變異(變異系數 > 10%)。與CON處理相比，EAN處理提高了小麥的胚根長度、胚根干重和根冠比變異系數，說明根系對高銨脅迫更加敏感。

表3 不同處理下小麥種子萌發相關指標的差異

同行數據后不同的大寫字母表示兩種處理間差異在P<0.01水平顯著。

Values followed by different capital letter mean significant difference between treatments at 0.01 level.

2.4 小麥耐高銨基因型篩選

將6個指標的耐銨指數進行相關性分析表明，胚根長度耐銨指數與胚芽鞘長度耐銨指數的相關性達到顯著水平；胚根干重耐銨指數與植株干重耐銨指數相關性達到極顯著水平，與根冠比耐銨指數呈顯著相關；胚芽鞘長度耐銨指數與胚根干重、根冠比耐銨指數的相關性達到極顯著水平，與植株干重耐銨指數呈顯著相關；胚芽鞘干重耐銨指數與植株干重和根冠比耐銨指數相關性達到極顯著水平(表4)。以胚根長度、胚芽鞘長度、植株干重和根冠比耐銨指數為指標，經歸一化處理后采用離差平方和法進行聚類分析(圖2)。將24個小麥品種劃分為三類：高銨敏感型、中間型和耐高銨型。其中，高銨敏感型品種以火燒頭、鎮麥9523，魯麥15等品種為代表；中間型以寧麥9號、小偃4號、南大2419等品種為代表；耐高銨型以豫麥49品種為代表。進一步分析表明，除根冠比耐銨指數在中間型和耐高銨型類群中差異不顯著外，其他指標在三個類群中差異均顯著(表5)。綜上，在高銨脅迫濃度為5.0 mM條件下，可以將胚根長度、胚芽鞘長度、植株干重和根冠比作為耐高銨脅迫基因型的篩選指標。

表4 小麥不同指標耐銨指數的相關性

RCL:胚芽鞘長度耐銨指數; RRL:胚根長度耐銨指數; RRDW:胚根干重耐銨指數;RCDW:胚芽鞘干重耐銨指數;RRSDW:剩余種子干重耐銨指數;RPDW:植株干重耐銨指數; RRSR:根冠比耐銨指數。下同。

RCL:Resistance ammonium index of coleoptile length;RRL:Resistance ammonium index of radicle length; RRDW:Resistance ammonium index of radicle dry weight;RCDW:Resistance ammonium index of coleoptile dry weight; RRSDW:Resistance ammonium index of remaining seed dry weight; RPDW:Resistance ammonium index of plant dry weight; RRSR:Resistance ammonium index of root/shoot ratio.The same in table 5.

圖2 24個小麥品種的系統聚類圖

表5 耐高銨脅迫的類群間差異

Table 5 Difference between two clusters in elevated ammonium nutrition tolerance indices

類型 TypeRRLRCLRRDWRCDWRPDWRRSR耐高銨型Resistance0.575a0.967a0.779a0.974a0.921a0.893a中間型Moderate0.508b0.921b0.710b0.885b0.876b0.848b高銨敏感型 Sensitivity0.447c0.881c0.622c0.820c0.804c0.834b

3 討論與小結

3.1 高銨脅迫臨界濃度的確定

植物生長受環境因子影響與限制，當某種因子超出植物生長所能承受的范圍時，會對植物產生脅迫作用。銨是植物生長的重要氮源之一，是參與植物生理生化過程的重要離子。隨著銨濃度的升高，植物受脅迫程度加劇。研究發現，低濃度銨(≤0.05mM)對植物生長發育有促進作用，而高濃度銨(5.0mM)抑制植物生長，表現在抑制種子萌發，降低根系生長速率和葉面積、葉片含水量和光合速率[5,7,17-19]，與本研究結果一致。在擬南芥不同突變體對銨營養響應的研究中發現，擬南芥在1.0 mM 和5.0 mM銨濃度下，初生根生長速率顯著降低，與硝態氮相比，5.0 mM銨水平抑制效果顯著[20-21]。本研究中，與硝態氮相比，5.0 mM銨濃度顯著降低了小麥萌發期發芽率、胚根長度、株高、胚芽鞘干重和胚根干重、萌發種子內α-淀粉酶活性、可溶性糖和游離氨基酸含量，增加了小麥萌發種子內淀粉含量，且此濃度下種子萌發階段被測形態和生理指標(第5天開始)均與對照差異達到顯著，證明5.0 mM為小麥萌發的高銨脅迫臨界濃度。

3.2 小麥耐高銨脅迫基因型篩選

植物品種對氮素營養響應的差異研究始于20世紀30年代，Schortemeyer等[22]研究發現，不同基因型玉米幼苗對20 mM銨的響應存在基因型差異。此外，在玉米、高粱、水稻、棉花、大豆和黑麥等作物上也均有這方面報道[23-24]。不同品種小麥自身存在基因型差異，本研究采用了耐銨指數(相對值)衡量不同小麥品種對銨的響應，以消除環境干擾以及品種自身生物性狀的差異。

已有較多高銨脅迫對作物幼苗生長影響的研究[20,25-26]，但大部分集中在擬南芥突變體材料以及不同物種間的比較。本研究對6個萌發相關指標耐性指數進行相關性分析表明，胚根長度耐銨指數與胚芽鞘長度耐銨指數的相關性達到顯著水平；胚根干重耐銨指數與植株干重耐銨指數相關性達到極顯著水平，與根冠比耐銨指數呈顯著相關；胚芽鞘長度耐銨指數與胚根干重、根冠比耐銨指數的相關性達到極顯著水平，與植株干重耐銨指數呈顯著相關；胚芽鞘干重耐銨指數與植株干重和根冠比耐銨指數相關性達到極顯著水平。因此，建議以胚根長度、胚芽鞘長度、植株干重和根冠比耐銨指數作為小麥種子萌發時期耐高銨基因型的篩選指標。通過聚類分析將24個供試小麥品種劃分為三類：高銨敏感型、中間型和耐高銨型。高銨敏感型和耐銨型間的6個被測指標間均呈現顯著性差異。高銨敏感型品種以火燒頭、鎮麥9523和魯麥15為代表；耐高銨型品種以豫麥49為代表。篩選出的耐高銨品種可以在以后的抗銨育種中作為種質材料加以應用。