自噬啟動因子ULK1的生物學功能與靶向治療研究進展

張 嵐，歐陽亮，劉 博*

(1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041)

自噬是一種高度保守的溶酶體降解過程，被35個自噬相關基因所調控[1]，其中Atg1是第一個被發現的酵母中的自噬蛋白，也是Atg蛋白中唯一的絲氨酸/蘇氨酸激酶[2].UNC-51樣激酶1(ULK1)作為Atg1在哺乳動物中的同源蛋白，具有與Atg1相同的自噬啟動功能[3].ULK1是自噬啟動步驟的主要調控因子，它與黏著斑激酶家族相互作用蛋白FIP200、自噬相關蛋白mAtg13和Atg101相互作用形成ULK復合體，ULK復合體的激活可進一步促進自噬體的形成.通常情況下，ULK復合體的形成是自噬過程所必需的.近年來的研究表明，除參與ULK復合體的形成外，ULK1還可被多種上游信號通路所調控，如自噬相關蛋白的磷酸化、泛素化和乙酰化等[4-5];同時ULK1還參與調控多種自噬信號通路及非經典信號通路，且這些信號通路與腫瘤、神經退行性疾病、感染性疾病等的發生發展密切相關[6].此外，最近的研究發現了大量直接或間接靶向ULK1調節自噬的小分子化合物，并將其應用于疾病的靶向治療[7-8].本文中主要闡述ULK1作為自噬啟動因子如何調控ULK復合體及其相關的自噬通路，以及ULK1與多種疾病的關系，并進一步揭示其作為潛在藥物靶點在靶向治療領域的應用前景.

1 ULK1的生物學功能

1.1 ULK1的功能結構域

ULK1作為一種細胞質激酶，是Atg1在哺乳動物中的同源蛋白，它與Atg1的序列相似度為29%.ULK1由1 050(人源)個氨基酸組成，分子質量為112.6 ku，或由1 051(鼠源)個氨基酸組成，分子質量為113 ku[3,9].ULK1的結構由一個N-端激酶結構域(KD)、一個脯氨酸/絲氨酸(PS)結構域和一個C-端結構域(CTD)組成(圖1).KD主要負責激酶活性的催化，而CTD包含2個微管作用和轉運(MIT)結構域，主要負責ULK1與mAtg13和FIP200的相互作用[9].另外，PS結構域包含約500個不保守的氨基酸，其中富含脯氨酸和絲氨酸，主要負責ULK1與自噬微管相關蛋白輕鏈3(LC3)的相互作用以及上游激酶對ULK1的磷酸化修飾[9].目前，ULK1的KD晶體結構已經被解析，與蛋白激酶A(PKA)的KD具有相似的特征[8].

哺乳動物基因組中共包含5個Atg1同源蛋白，分別為ULK1、ULK2、ULK3、ULK4和STK36，其中ULK1和ULK2在全長蛋白上表現出廣泛的序列相似性，而ULK3、ULK4和STK36只在KD與Atg1具有一定的序列相似性[2].由于ULK2與ULK1有52%的序列相似度，早期認為ULK2也參與細胞自噬的調控，在自噬體形成的最初步驟中起必要作用;然而通過基于激酶特異性siRNA表達文庫的篩選，發現在氨基酸饑餓誘導的HEK293細胞中敲除ULK1基因可抑制細胞自噬，而敲除ULK2基因則不會抑制細胞自噬，表明在哺乳動物細胞自噬中起作用的是ULK1而非ULK2[10].隨后的研究發現ULK1/2在細胞和動物水平表現為功能冗余，即當ULK1的作用逐漸減弱時，ULK2的作用可能相應增強，兩者調控自噬啟動的功能可互補[11].ULK1和ULK2在大部分組織中廣泛表達，但特定ULK亞型可在特定細胞環境中發揮主導作用，例如ULK1基因敲除小鼠在紅細胞發育和原代肝細胞線粒體自噬過程中均存在缺陷，說明ULK2與ULK1的功能并不完全相同[4,12].

圖1 ULK1的功能結構域Fig.1 The functional domains of ULK1

1.2 ULK復合體

ULK1可與mAtg13、FIP200和Atg101形成ULK復合體，并進一步激活下游自噬信號通路，促進自噬體的形成.2008年，首次發現FIP200在哺乳細胞中與ULK1存在直接相互作用，是參與自噬體形成的關鍵因子[13].隨后發現mAtg13可參與ULK復合體的形成，與ULK1和FIP200存在直接相互作用，其中mAtg13與ULK1的CTD結合[14].進一步的研究證實mAtg13通過其C-端一段極短的肽鏈(Thr478、Leu479和Gln480)與ULK1相互作用[15].在正常情況下，mAtg13和FIP200均可單獨參與調節ULK1的激酶活性，但兩者協同作用可最大程度地激活ULK1的活性.隨后發現在哺乳動物細胞中Atg101作為mAtg13的附屬蛋白，可與ULK1、mAtg13、FIP200形成四重復合體[16];而在酵母中暫未發現Atg101的同源或功能相似蛋白[17].目前Atg101在自噬中的作用還不十分清楚，但最新研究發現Atg101-Atg13HORMA復合體中Atg101的CTD是ULK1復合體與磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)復合體相互作用的關鍵區域，該結構域缺失會顯著影響兩個復合體的相互作用及自噬體形成[18].

1.3 ULK1與自噬相關通路的關系

1.3.1 ULK1的上游信號通路

ULK1是一種在哺乳動物細胞的自噬體膜上廣泛表達的蛋白激酶[19]，其活性可被多個上游信號通路所調控.例如，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mTORC1)和腺苷單磷酸依賴型蛋白激酶(AMPK)直接參與ULK1活性的調控.在正常條件下，AMPK處于失活狀態，mTORC1通過磷酸化ULK1的Ser637/Ser638和Ser757/Ser758位點抑制其活性，并通過磷酸化mAtg13的Ser258位點阻止ULK1的激活[20-22].當營養供給受限時，ULK1能磷酸化TOR1調節相關蛋白(Raptor)，阻止mTOR與底物Raptor的結合從而抑制mTORC1的信號通路[23].而AMPK既可通過磷酸化Raptor解除mTORC1對ULK1的抑制作用，也可直接磷酸化ULK1的多個位點來激活ULK1[4,21].此外，在饑餓誘導條件下，蛋白激酶Cα(PKCα)可與ULK1相互作用，并磷酸化ULK1的Ser423位點而阻斷自噬，但這一磷酸化并不會影響ULK復合體和ULK1的活性，而是通過降低ULK1與突觸融合蛋白17(STX17)的親和力來阻斷自噬體-溶酶體的融合從而抑制自噬[24].在長期饑餓條件下，ULK1在Thr180位點的自身磷酸化可促進Kelch樣蛋白20(KLHL20)對ULK1的泛素化及其對ULK1和VPS34復合體成分的降解，而這一過程有助于自噬的終止，防止過度自噬的發生[25].最近一項研究還發現絲裂原活化蛋白激酶15(MAPK15)是ULK復合體的一部分，并可通過調控ULK1的磷酸化增強ULK復合體的活性，調節自噬過程的早期階段[26].

除上述磷酸化調控外，ULK1還受泛素化、乙酰化和糖基化等調控.例如，自噬和Beclin-1調節因子1(AMBRA1)可與腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)這一E3泛素連接酶形成復合體，對ULK1的Lys63位點進行泛素化而調控其穩定性與激酶活性[5].分子伴侶樣蛋白p32可與ULK1形成復合體調控ULK1的穩定性，而p32的缺失會增強ULK1在Lys48位點的泛素化，同時抑制Lys63位點的泛素化，導致ULK1被蛋白酶體降解[27].神經前體細胞表達發育下調基因4樣蛋白(NEDD4L)也可對ULK1的Lys925和Lys933位點進行泛素化，使其被蛋白酶體降解，防止細胞過度自噬而死亡[28].此外，ULK1的Ser929、Ser930和Thr931位點被磷酸化后有助于NEDD4L對ULK1的泛素化和降解[29].在亞硒酸鹽誘導的線粒體自噬中，線粒體E3泛素蛋白連接酶1(MUL1)可與ULK1相互作用，促進ULK1 形成Lys48多聚泛素鏈，進而使其被蛋白酶體降解[30].泛素特異性肽酶24(USP24)可通過影響ULK1的泛素化和蛋白穩定性來調控自噬，敲減USP24可顯著提高ULK1的表達水平并增加細胞自噬通量[31].USP1是調節ULK1的Lys63位點去泛素化的關鍵分子，抑制USP1可降低ULK1蛋白的表達并阻斷經典自噬途徑，但可激活非經典自噬途徑來降解p62蛋白[32].而USP20可通過去泛素化結合并穩定ULK1，從而阻止ULK1被溶酶體降解，這一過程對饑餓誘導的自噬啟動是不可或缺的[33].除泛素化修飾外，在生長因子缺乏的條件下，HIV-1病毒穿膜肽 Tat相互作用蛋白60(TIP60)的Ser86位點會被糖原合成酶激酶3(GSK3)磷酸化，且TIP60能通過乙酰化ULK1調節其活性，此過程并非單一模式的調節，而是通過GSK3-TIP60-ULK1通路連接磷酸化和乙酰化兩種不同的修飾形式[34].最新研究發現ULK1的Thr754位點可被N-乙酰葡糖胺轉移酶(OGT)糖基化，這對ULK1與Atg14的結合、Atg14的磷酸化、Ⅲ型PI3K(PI3KC3/VPS34)的激活及吞噬泡形成等均非常重要[35].此外，還有一些轉錄因子或蛋白可直接調控ULK1的表達，例如：ULK1是轉錄激活因子4(ATF4)的直接靶點，在缺氧或內質網應激條件下，ATF4可上調ULK1的mRNA和蛋白表達水平而激活細胞自噬[36];在信號轉換器和轉錄激活器1(STAT1)缺失的細胞中，ULK1的mRNA和蛋白表達水平以及自噬水平均明顯提高，表明STAT1可負調控ULK1的表達而抑制細胞自噬[37].

1.3.2 ULK1的下游信號通路

ULK1及其復合體作為自噬的啟動因子，還參與調控大量下游自噬相關的信號通路.例如：Beclin-1作為哺乳動物中Atg6的同源蛋白，是ULK1的下游直接靶點，它可與PI3KC3/VPS34和PI3K調控亞基4(PI3KR4/VPS15)結合形成復合體調控自噬；在氨基酸缺失或mTORC1受抑制的條件下，激活ULK1可磷酸化Beclin-1的Ser14位點，提高Beclin-1-VPS34-Atg14L復合體的活性，誘導細胞自噬[38].另有研究發現ULK1可磷酸化Atg14的Ser29位點，導致Atg14-VPS34復合體的活性增加并激活自噬[39].ULK1還可磷酸化Beclin-1的Ser30位點，激活Atg14-VPS34復合體，且這一過程完全獨立于ULK1對Beclin-1(Ser14位點)和Atg14(Ser29位點)的磷酸化[40].此外，AMBRA1能與動力蛋白輕鏈1(DLC1)結合形成復合體而保持失活狀態，當自噬啟動時，ULK1通過對AMBRA1的磷酸化使其從復合體中解離出來，轉位到內質網，與Beclin-1-VPS34一起參與自噬體形成[41].

在饑餓條件下，酪氨酸蛋白激酶Src和ULK1可分別磷酸化Atg9的Tyr8和Ser14位點，協同促進Atg9與銜接蛋白復合物1/2(AP1/2)的相互作用，誘導Atg9的膜泡運輸和細胞自噬啟動[42].ULK1能磷酸化Atg4B的Ser316位點，降低Atg4B的活性，而蛋白磷酸酶2A(PP2A)可去除這一磷酸化抑制，兩者共同調控Atg4B的活性及LC3-Atg4B復合體的形成[43].此外，卵巢濾泡激素(FLCN)與γ-氨基丁酸受體相關蛋白(GABARAP)可在卵巢濾泡激素互作蛋白1(FNIP1)或FNIP2的存在下形成FLCN-GABARAP復合體，ULK1可通過磷酸化FLCN的Ser406、Ser537和Ser542位點調控該復合體的活性從而調控自噬[44].在饑餓條件下，ULK1可磷酸化DENN結構域包含蛋白3(DENND3)的Ser554和Ser572位點，DENND3進一步激活Ras相關蛋白Rab12，激活的Rab12再與LC3結合則可促進自噬體轉運和誘導自噬[45].在饑餓條件下，ULK1還可磷酸化蛋白轉運蛋白SEC23B的Ser186位點，阻斷SEC23B和F-box/WD重復蛋白5(FBXW5)的相互作用，進而抑制SEC23B的降解;而被磷酸化穩定后的SEC23B可與SEC24A和SEC24B結合，重新定位于內質網和高爾基體之間的間隙，增加自噬通量[46].

1.4 ULK1調控的非經典信號通路

除調控經典的自噬相關通路外，ULK1還可參與一些非經典信號通路的調控.例如：在特殊壓力刺激導致的細胞自噬中，蛋白磷酸酶1D(PPM1D)可與ULK1直接作用，并對其Ser637位點去磷酸化，激活基因毒性誘導的自噬，這一過程依賴于p53的激活[47].蛋白酶體抑制或蛋白毒性應激可誘導p62泛素關聯域(UBA)的Ser409位點被ULK1磷酸化，增加p62與泛素結合的親和力，但這一現象在營養缺乏時不會發生;自噬蛋白的多聚泛素化降解依賴于p62的Ser409位點磷酸化，該位點的突變會導致p62的積累、自噬蛋白的異常定位和積聚蛋白的異常清除[48].

此外，ULK1還參與如線粒體自噬等選擇性自噬的調控.應激誘導蛋白Sestrin-2(SESN2)能與ULK1作用，促進ULK1對p62的Ser403位點磷酸化，激活p62介導的選擇性自噬[49].SESN2還可促進ULK1對Beclin-1的Ser14位點磷酸化，進一步增強Beclin-1與Parkin蛋白的結合，促進Parkin向線粒體膜的易位，激活線粒體自噬[50].ULK1可與Ras相關蛋白Rab9、受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Rip1)、線粒體分裂蛋白(Drp1)形成復合體，ULK1和Rip1可分別磷酸化Rab9的Ser179位點和Drp1的Ser616位點，使與Rab9相關的蛋白跨高爾基膜被募集到受損的線粒體，通過線粒體自噬將其清除[51].在缺氧或線粒體解耦條件下，ULK1可易位到受損線粒體上并磷酸化FUN14結構域包含蛋白1(FUNDC1)的Ser17位點，增強FUNDC1和LC3的結合，促進線粒體自噬從而清除受損線粒體;而FUNDC1的突變導致其缺失與ULK1的結合能力，從而阻止ULK1轉位并抑制線粒體自噬[52].核結構域10蛋白52(NDP52)異位到線粒體或過氧化物酶體也可定位并激活ULK1復合體，從而啟動選擇性自噬，其通過與FIP200/ULK1復合體的相互作用誘導線粒體自噬;而TANK結合激酶1(TBK1)可進一步增強NDP52與ULK1復合體的相互作用，促進線粒體自噬[53].

除調控自噬外，ULK1還可與凋亡蛋白相互調控.在急性髓系白血病(AML)中，ULK1為Caspase-3的直接作用底物，Caspase-3可通過直接剪切ULK1的Asp485位點來抑制細胞自噬的發生，從而調控表達AML1-ETO9a(AE9a)融合蛋白的胎兒肝細胞的自我更新能力和白血病原性，阻止AML的發生和進展[54].在活性氧壓力應激下，ULK1定位于細胞核內，可增強聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)的活性，促進細胞發生壞死性凋亡，且不依賴于ULK1調控的細胞自噬;在此過程中,ULK1的激酶活性對于ULK1的入核及PARP1的激活均十分重要[55].

此外，ULK1還參與一些炎癥和應激機制的調控.循環二核苷酸(CDNs)促進干擾素基因蛋白刺激器(STING)的功能，而STING可將TBK1運送到核內體/溶酶體，并激活干擾素調節因子3(IRF3)和核因子κB(NF-κB);隨后ULK1對STING的Ser366位點磷酸化，而STING的磷酸化可避免炎癥細胞因子的持續產生，防止先天免疫基因的持續轉錄[56].Ⅰ型干擾素受體(IFNR)可磷酸化ULK1的Ser757位點，ULK1被激活后進而磷酸化MAPK p38[57].而p38也被發現可磷酸化ULK1的Ser757位點并降低ULK1的激酶活性，阻止其與下游效應蛋白Atg13結合，降低神經小膠質細胞的自噬水平，促進細胞的炎癥反應[58].含纈酪肽蛋白(VCP/p97)突變是家族性包涵體肌病(IBM)最常見的病因，研究發現ULK1/2可定位于應激顆粒并磷酸化VCP的Ser13、Ser282和Thr761位點，增加VCP分解應激顆粒的活性[59].ULK1還可對其底物細胞分裂周期蛋白37(Cdc37)的Ser339位點磷酸化，降低Cdc37與下游靶激酶的相互作用，破壞靶激酶的穩定性，從而提高腫瘤細胞對熱休克蛋白90(HSP90)抑制劑的敏感性[60].此外，ULK1/2在發育中的小鼠前腦中可通過非經典途徑共同調控軸突導向，缺乏ULK1/2的小鼠中樞神經系統在軸突尋路方面存在缺陷;缺失ULK1/2還會導致神經元死亡，這可能是由細胞內的未折疊蛋白反應(UPR)導致的[61].進一步研究發現，ULK1/2可磷酸化蛋白轉運蛋白SEC16A的Ser469位點，調控特異性底物從內質網到高爾基體的轉運;而在缺失ULK1/2的細胞中，內質網-高爾基體轉運功能的缺陷會激活UPR，誘導神經元的死亡[62].綜上，ULK1調控的自噬信號通路總結于圖2，ULK1及相關底物蛋白的修飾方式詳見表1.

2 ULK1與疾病的關系

ULK1及其調控的細胞自噬信號通路與多種疾病的發生發展密切相關，近期研究表明ULK1可在多種疾病的治療中作為候選藥物靶點.

2.1 與腫瘤的關系

細胞自噬通常被視為一種保護細胞存活的途徑，但它也具有抑制腫瘤的功能.有研究認為自噬作用在腫瘤發展的不同階段有所不同，在腫瘤發生初期，自噬可限制腫瘤細胞的增殖，但在腫瘤形成后又可應對各種壓力刺激從而保護腫瘤細胞，防止腫瘤細胞被侵襲和轉移;此外，自噬還可通過細胞或組織特異性的方式影響腫瘤的發生[6].因此，在腫瘤發生發展的過程中，細胞自噬顯示出其兩面性的作用.

ULK1作為自噬的啟動因子，在不同腫瘤中也扮演著不同的角色.ULK1的表達在某些腫瘤組織中明顯下調，因此激活ULK1調控的自噬性細胞死亡成為一種潛在的治療策略.例如：有研究發現ULK1表達的下調和乳腺癌的進展密切相關，同時還伴隨自噬水平的下降，表明ULK1可能是乳腺癌中獨立的預后因子[63].最近，劉博課題組基于癌癥基因組樣本(TCGA)和組織芯片分析，發現ULK1在乳腺癌的組織樣本中表達顯著下調，尤其是在三陰性乳腺癌(TNBC)中下調更加明顯[7,64].在很多腫瘤組織中ULK1的表達上調，因此抑制ULK1調控的保護性細胞自噬在這些腫瘤中成為一種理想的治療策略.例如：研究發現ULK1在肝細胞癌(HCC)中的表達水平可作為HCC的重要預后因子，結合ULK1與LC3B的表達進行綜合評估時，能顯著改善對患者預后評估的準確性[65].利用免疫組化方法檢測ULK1在鼻咽癌患者中的表達，結果發現ULK1的高表達通常與較短的疾病特異性生存期(DSS)相關，因此檢測ULK1的表達水平也可作為預測鼻咽癌患者治療反應及不良預后的一種輔助方法[66].在雄激素阻斷治療(ADT)后發生腫瘤轉移的前列腺癌(PCa)患者中，ULK1和富含亮氨酸的PPR基元蛋白(LRPPRC)表達水平的升高與其較短的生存期密切相關，表明ULK1的高表達可作為轉移性PCa的有效生物標志物[67].最近一項針對胃癌的研究發現ULK1在胃癌細胞系及患者胃癌組織中均高表達，siRNA敲減ULK1后可抑制胃癌細胞的存活和增殖，而過表達ULK1則會促進胃癌細胞的增殖;且ULK1的高表達與胃癌的T分級及復發密切相關，表明ULK1可作為胃癌的一個生物標記物及預后因子[68].基于TCGA數據庫的分析也發現在透明腎細胞癌(CCRCC)組織中ULK1異常高表達，通過shRNA敲減ULK1或使用ULK1抑制劑干預可顯著抑制癌細胞的自噬水平并誘導細胞凋亡[69].此外，ULK1介導的細胞自噬還可通過誘導保護性細胞自噬使腫瘤細胞對靶向藥物或化療藥物產生耐藥性，從而逃避死亡.例如：布羅莫結構域和額外終端結構域(BET)抑制劑JQ1可通過激活AMPK-ULK1通路引起白血病干細胞自噬的激活，進而使細胞對JQ1產生耐藥性，這表明保護性細胞自噬是JQ1用于治療AML藥物耐受的機制之一[70].顆粒鈣蛋白(GCA)通過激活TRAF6泛素連接酶的活性可誘導ULK1的Lys63位點泛素化，進一步使ULK1穩定和激活，促進保護性細胞自噬從而使慢性髓系白血病(CML)細胞對伊馬替尼產生耐藥性[71].綜上所述，根據自噬在不同腫瘤中所表現出的不同作用，可分別通過激活或抑制ULK1來調控自噬，從而對腫瘤進行靶向治療.

圖2 ULK1復合體的翻譯后修飾及其調控的信號通路Fig.2 Post-translational modifications of the ULK1 complex and its regulatory signaling pathways

2.2 與神經退行性疾病的關系

目前，大量研究表明細胞自噬功能障礙在神經退行性疾病的發病過程中起到十分重要的作用，因此靶向細胞自噬，尤其是自噬-溶酶體降解途徑對神經退行性疾病進行治療已成為近年來的研究熱點.ULK1作為細胞自噬的啟動因子，也可作為潛在靶點來治療神經退行性疾病.有研究報道在帕金森病(PD)患者的外周血單核細胞(PMBCs)中，ULK1的mRNA水平與正常人相比較低[72].在衰老導致的大鼠認知缺陷模型中，研究發現與普通成年鼠相比，老齡鼠大腦中的海馬體部分表現出細胞凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2比值和Caspase-3活性明顯升高，同時自噬相關的p-ULK1/ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅱ比例顯著降低，表明ULK1等自噬蛋白的缺失在認知缺陷類神經退行性疾病發病機制方面可能起重要作用[73].在Q175小鼠亨廷頓病(HD)模型中，ULK1對Beclin-1和Atg14的磷酸化水平及Atg14-VPS34復合體的活性均有所降低，導致自噬水平下降，細胞對聚集蛋白的清除能力降低[39].9號染色體開放閱讀框72(C9ORF72)的單倍劑量不足可引起肌萎縮性側索硬化癥(ALS)和額顳葉癡呆(FTD)，最近的研究發現C9ORF72/史密斯-馬吉尼斯綜合征染色體區域候選基因8(SMCR8)復合體可調控ULK1介導的細胞自噬[74-75].另一項研究還發現C9ORF72可與ULK1直接相互作用，而C9ORF72在Rab1的作用下可調控ULK1復合體向吞噬泡的易位;雖然C9ORF72的缺失并不會影響ULK1的激活，但是可引起神經元中p62發生聚集，這與C9ORF72突變導致的ALS/FTD中出現p62聚集的生理現象是一致的;且在ALS/FTD患者的組織中也發現自噬水平下降，進一步證明了C9ORF72調控ULK1介導的細胞自噬在ALS/FTD發病機制中的關鍵作用[76].舞蹈癥-棘紅細胞增多癥(ChAc)是一種遺傳性神經退行性疾病，研究發現在患者的紅細胞中一種Src家族酪氨酸激酶(SFK)Lyn可與ULK1相互作用，形成Lyn-ULK1復合物并在細胞中大量聚集，導致自噬-溶酶體降解功能發生障礙，延緩積聚毒蛋白的清除[77].此外，ULK1在保護缺氧引起的缺血性腦梗死(ICI)中也有重要作用，研究發現過表達ULK1可促進FUNDC1的激活，減少缺氧引起的神經細胞凋亡，而抑制ULK1的表達則起到相反的作用[78].ULK1還被發現在豬血凝性腦脊髓炎病毒(PHEV)誘導的神經系統障礙中具有重要調控作用，受PHEV感染后的小鼠原代皮層神經元中ULK1表達顯著降低，提示PHEV引起的神經系統障礙可能與ULK1缺陷相關；而ULK1可選擇性地啟動神經生長因子(NGF)/酪氨酸激酶受體A(TrkA)，促進神經突起的生長、神經側枝的生芽及內體運輸[79].綜上所述，在神經退行性疾病中激活ULK1調控的保護性自噬將是一種具有廣闊前景的治療策略.

表1 ULK1復合體及ULK1調控的自噬通路的翻譯后修飾方式

2.3 與感染性疾病的關系

目前，大量研究表明ULK1可調控某些感染性疾病相關的自噬通路.在干擾素γ(IFN-γ)介導的抗病毒反應中，IFN-γ可激活ULK1，隨后ULK1與混合譜系激酶3(MLK3)相互作用并使其磷酸化，同時激活細胞外信號調節激酶5(ERK5)來促進IFN-γ調控的抗病毒基因轉錄，這一ULK1-MLK3-ERK5信號通路的激活對于IFN-γ介導的抗病毒反應十分重要[80].在朊病毒感染的倉鼠大腦中，AMPK-ULK1通路的激活有助于自噬的發生，從而促進感染朊病毒的腦組織中損傷因子的清除;而在感染了病毒的SMB-S15細胞中敲除ULK1基因則會抑制LC3的脂化，抑制細胞自噬的激活[81].免疫相關鳥苷三磷酸酶(IRGM)作為克羅恩病(CD)和肺結核的危險因子，被發現可與ULK1相互作用，促進ULK1和Beclin-1的協同組裝，從而調控自噬起始復合體的形成，在先天免疫系統中起到抗菌和抗炎作用[82].此外，研究發現ULK1的非編碼單核苷酸多態性(SNP)位點rs12297124與結核分枝桿菌感染密切相關，并在ULK1調控腫瘤壞死因子(TNF)的分泌、結核分枝桿菌誘導的非特異性自噬及結核分枝桿菌在單核細胞中的復制方面發揮重要作用[83].核苷結合寡聚域蛋白2(NOD2)和受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(RIPK2)缺失的小鼠對甲型流感病毒的感染具有很強的敏感性，這是由于RIPK2缺失會引起細胞線粒體自噬功能缺陷，使線粒體產生超氧化物增多，受損線粒體積聚，從而導致NACHT、LRR和PYD域蛋白3(NLRP3)炎性小體活化增強，產生白細胞介素-18(IL-18);而RIPK2可通過磷酸化ULK1調控線粒體自噬，清除炎性小體并保護細胞免受炎癥反應的損傷[84].丙型肝炎病毒(HCV)可引發人類免疫相關的GTPase M(IRGM)對ULK1的Ser757位點去磷酸化，激活細胞自噬，進一步促進病毒復制，而敲除ULK1/2后可明顯減少HCV的復制和HCV感染性粒子的形成[85].綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)可通過抑制AKT1和mTOR誘導細胞自噬，而膜聯蛋白A2(AnxA2)可通過AKT1-mTOR-ULK1/2信號通路調控自噬，促進宿主細胞對綠膿桿菌的免疫[86].綜上可見ULK1調控的自噬在感染性疾病中主要起到細胞保護的作用，因此靶向ULK1調控的自噬可能成為治療感染性疾病的一種新方法.

2.4 與其他疾病的關系

ULK1調控的自噬也涉及其他類型的疾病，如Ⅱ型糖尿病和心血管疾病.脂肪酸(如棕櫚酸)可阻斷AMPK-ULK1通路的活化，從而抑制自噬造成的功能障礙性線粒體積累，同時促進活性氧(ROS)的生成;線粒體中ROS的增加會促進NLRP3炎癥小體的激活及IL-1β的釋放;而造血細胞炎癥小體的激活及IL-1β的釋放會破壞多個靶組織/器官的胰島素信號，從而降低這些靶組織/器官對葡萄糖的耐受和對胰島素的敏感性[87].在Ⅱ型糖尿病大鼠模型中，AMPK-ULK1通路的受損會抑制腎臟近端小管中自噬的激活，進一步導致腎缺血再灌注損傷發生惡化[88].在心血管疾病中，研究發現節食可提高心肌細胞中ULK1介導的自噬激活，而自噬的激活可有效防止心肌梗死后的慢性心力衰竭[89].肥胖可引起心臟脂蛋白脂肪酶(LPL)蛋白水平的顯著升高，同時伴隨著心臟自噬水平和ULK1蛋白水平的顯著下調，由此引發肥胖患者的心肌病,而有研究發現ULK1調控的細胞自噬可通過蛋白酶水解將LPL降解，預防肥胖患者發生心功能障礙[90].在高糖誘導的心肌損傷中，mTOR誘導的ULK1失活可抑制細胞自噬，保護心肌細胞免受高糖毒性損傷[91].急性酒精刺激可導致心臟的自噬水平升高和收縮功能障礙，而抑制AMPK或ULK1后可顯著減少自噬體積累及心肌細胞死亡，表明ULK1在急性酒精刺激后由AMPK介導的心肌細胞自噬、凋亡和心肌收縮功能障礙中發揮重要作用[92].綜上所述，ULK1在Ⅱ型糖尿病和心血管疾病中的角色較復雜，因此靶向ULK1調控的自噬來治療Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的策略還有待進一步細化研究.

3 靶向ULK1調控細胞自噬的疾病治療

已有研究報道了一系列可直接或間接調控ULK1及其介導的自噬通路的小分子化合物，并將它們廣泛應用于自噬調控相關的疾病治療.根據ULK1表達水平的差異和不同疾病中ULK1的特異性調控機制，這些化合物主要被分為ULK1的靶向抑制劑、激動劑及間接調控ULK1相關通路的小分子化合物.

3.1 ULK1靶向抑制劑

2015年，Lazarus等[8]首次報道了ULK1的KD晶體結構，并基于ULK1的晶體結構利用32P-ATP放射實驗和高通量篩選發現了化合物6，該化合物也是首個被報道的ULK1靶向抑制劑.雖然化合物6對ULK1具有較高的親和力(半數抑制濃度IC50=8 nmol/L)，但是它并非特異性的ULK1抑制劑，因此限制了其在自噬研究中的進一步應用.為了提高ULK1抑制劑的特異性，Lazarus等[93]又開發了一系列具有新型骨架的ULK1抑制劑，其中化合物3具有較好的特異性，但其對ULK1的抑制活性相對較弱(對ULK1的IC50=120 nmol/L，對ULK2的IC50=360 nmol/L).此外，Egan等[94]通過篩選發現了一種高選擇性的ULK1抑制劑SBI-0206965，該化合物能直接抑制ULK1的激酶活性(對ULK1的IC50=108 nmol/L,對ULK2的IC50=711 nmol/L)，從而抑制ULK1對VPS34的磷酸化并進一步抑制細胞自噬;研究還發現將SBI-0206965和mTOR抑制劑rapamycin聯用可發揮協同作用殺死非小細胞肺癌(NSCLC)細胞，表明ULK1抑制劑在臨床上具有很大的治療潛力.隨后，SBI-0206965也被逐漸應用于其他腫瘤的治療，如使用SBI-0206965靶向抑制ULK1可促進神經母細胞瘤(NB)細胞發生凋亡，同時還可抑制腫瘤細胞的生長和轉移[95].此外，利用SBI-0206965抑制ULK1的激酶活性，在CCRCC中也展現出很好的治療潛力[69].Petherick等[96]也發現了一類ULK1/2抑制劑MRT67307和MRT68921，其中MRT67307對ULK1的IC50=45 nmol/L,對ULK2的IC50=38 nmol/L，與之相比，MRT68921對ULK1(IC50=2.9 nmol/L)和ULK2(IC50=1.1 nmol/L)具有更強的親和力，但兩者均無法特異性抑制ULK1.在敲除ULK1/2基因的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中轉染表達重組野生型ULK1和ULK1(M92T)突變體蛋白，發現MRT68921僅在表達重組野生型ULK1蛋白的MEF中可抑制Atg13的磷酸化和自噬體的形成，而在表達突變體蛋白的MEF中無法抑制自噬體的形成，表明MRT68921在細胞內是通過靶向抑制ULK1來抑制細胞自噬的[96].Wood等[97]基于高通量篩選和結構修飾發現了一種以吲哚衍生物為骨架的ULK1抑制劑，命名為化合物3g，它對ULK1的親和力和MRT67307的一致(IC50=45 nmol/L)，且在人、大鼠和小鼠的微粒體中展現出良好的穩定性及極微弱的細胞色素P450酶(CYP)抑制活性，表明其具有良好的安全性和成藥性.最近，Martin等[98]又發現了一類新的強效、強選擇性的ULK1抑制劑ULK-100(對ULK1的IC50=1.6 nmol/L,對ULK2的IC50=2.6 nmol/L)和ULK-101(對ULK1的IC50=8.3 nmol/L，對ULK2的IC50=30 nmol/L)，其中ULK-101可通過抑制ULK1的活性使Kras基因突變的肺癌細胞對營養剝奪更敏感，表明其可用于某些特定類型腫瘤的聯合治療.上述ULK1靶向抑制劑及其相關作用機制和應用總結于表2.

3.2 ULK1靶向激動劑

2017年，劉博課題組[64]基于ULK1的KD設計了首個靶向ULK1的小分子激動劑LYN-1604，其半數有效濃度EC50=18.94 nmol/L;基于定點突變技術和體外激酶實驗，發現Lys50、Leu53和Tyr89位點對LYN-1604結合并激活ULK1十分重要;此外，LYN-1604在TNBC細胞中可靶向激活ULK1及其復合體，誘導ULK1介導的自噬相關死亡和細胞凋亡，并在細胞和動物水平上均表現出良好的抗TNBC效果.最近，劉博課題組[99]又發現了另一種ULK1靶向激動劑BL-918，該化合物對ULK1的EC50=24.14 nmol/L，且細胞毒性極低;BL-918可通過激活ULK復合體在NB細胞(SH-SY5Y)和大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC-12)中誘導自噬，并對1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(MPP+)損傷的SH-SY5Y表現出顯著的保護作用;在小鼠PD模型中BL-918可緩解1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘發的運動功能障礙和多巴胺能神經元喪失.這些結果表明靶向ULK1用于治療腫瘤或神經退行性疾病具有一定的潛力，而這些ULK1的新型激動劑可作為未來TNBC或PD治療的候選藥物.上述ULK1靶向激動劑及其相關作用機制和應用總結于表2.

表2 靶向ULK1及ULK1介導自噬通路的小分子化合物

3.3 間接調控ULK1的小分子化合物

其他一些小分子化合物也被發現可間接調控ULK1介導的自噬信號通路.例如：替莫唑胺(temozolomide)可通過ATM-AMPK-ULK1通路誘導自噬治療神經膠質瘤[100].漢防己甲素(tetrandrine)可通過提高p-ULK1和p-mTOR的水平誘導自噬性細胞死亡，抑制口腔癌細胞的增殖[101].在MDA-MB-231細胞中，黃芩素(baicalein)通過激活AMPK-ULK1通路和抑制mTORC1信號通路誘導自噬性細胞死亡[102].水仙環素(narciclasine)可抑制TNBC細胞增殖并誘導自噬依賴的細胞凋亡，該過程依賴于AMPK-ULK1通路的激活[103].氯氮平(clozapine)作為一種經典的非典型抗精神病藥，在大鼠額葉皮層可通過激活AMPK-ULK1-Beclin-1通路發揮其抗精神紊亂的作用[104].人參皂苷Rg2(ginsenoside Rg2)是一種類固醇糖苷類化合物，它可在多種細胞模型中通過激活AMPK-ULK1通路誘導自噬并清除蛋白聚集物，有效改善阿爾茨海默病(AD)小鼠的認知行為[105].白藜蘆醇(resveratrol)可通過激活AMPK-ULK1通路和抑制mTORC1信號級聯活性誘導小鼠胚胎干細胞(mESCs)的自噬，并提高干細胞的多能性[106].竹節參皂苷Ⅳa(Chikusetsusaponin Ⅳa)可通過激活AMPK-mTOR-ULK1通路激活自噬，從而減輕異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌纖維化現象[107].銀杏內酯K(ginkgolide K)在氧糖剝奪的條件下，可通過激活AMPK-mTOR-ULK1通路誘導保護性細胞自噬，從而促進星形膠質細胞的增殖和遷移[108].鳶尾素(irisin)可通過激活AMPK-ULK1通路以不依賴mTOR的方式誘導保護性細胞自噬，緩解壓力過載引起的心臟肥大[109].甘草查爾酮A(licochalcone A)在肝癌細胞中可誘導ULK1-Atg13介導的細胞自噬及ROS相關通路，且抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)可增強甘草查爾酮A誘導的細胞凋亡，促進其對肝癌細胞的殺傷[110].此外，還有一些小分子化合物可通過抑制ULK1相關的信號通路影響細胞自噬.例如：去泛素化酶抑制劑WP1130可抑制ULK1的去泛素化，導致ULK1泛素化水平升高，抑制ULK1的活性，從而抑制ULK1復合體及自噬進程[111].金絲桃苷(hyperoside)可通過抑制AMPK-ULK1通路減輕D-半乳糖引起的腎臟老化和損傷[112].牡荊素(vitexin)可通過抑制mTOR-ULK1通路逆轉大腦中動脈閉塞(MCAO)導致的自噬功能障礙，從而減輕MCAO引起的缺血性腦卒中[113].上述間接調控ULK1的小分子化合物及其相關作用機制和應用總結于表2.

4 總結與展望

ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為酵母Atg1在哺乳動物中的同源蛋白，也是自噬的啟動因子.而ULK復合體(ULK1-mAtg13-FIP200-Atg101)的形成是啟動自噬過程所必需的.雖然ULK1的原始生物功能是啟動自噬，但是其調控和修飾(主要為磷酸化)使其成為調控子參與多個重要的信號通路，并可應用于多種疾病治療，如腫瘤和神經退行性疾病.已有研究表明靶向ULK1的小分子藥物具有一定的可行性，如ULK1抑制劑SBI-0206965可單獨或與其他藥物聯合使用，用于治療NSCLC、NB、CCRCC等.此外，LYN-1604和BL-918作為ULK1激動劑，可通過直接激活ULK1及其調控的自噬性細胞死亡或保護性細胞自噬，用于TNBC和PD的治療，表明靶向ULK1在疾病治療，尤其是一些自噬缺陷或自噬功能障礙的疾病治療中具有一定的應用前景.

然而，針對ULK1設計小分子靶向藥物仍有很多亟需解決的問題.如目前僅解析了ULK1的KD晶體結構，ULK1及ULK復合體晶體結構的進一步解析將有助于發現更多特異性靶向其功能的小分子抑制劑和激動劑，并應用于各種疾病的治療.同時，開發靶向ULK1的變構抑制劑和激動劑也是該類藥物未來的發展方向之一，這將進一步提升ULK1靶向藥物的特異性并有效降低脫靶導致的藥物毒副作用.此外，除一些經典的ULK1介導的自噬途徑外，還需進一步探索非典型的調控通路，例如目前發現的ULK1在調控細胞凋亡(PARP1、Caspase-3等)中也具有一定的作用，這些發現將為疾病的靶向治療提供更多的可能性.綜上所述，隨著ULK1功能和應用研究越來越成熟，未來有望出現更多針對ULK1的分子靶向治療手段用于各類疾病的治療.