載紫杉醇的pH敏感型熱休克蛋白納米載體的腫瘤細胞攝取特性及藥理學評估

楊惠卿，王 喻，駱紅飛，趙子明

(1.浙江中醫藥大學附屬第二醫院，浙江 杭州 310005；2.徐州醫科大學藥學院，江蘇 徐州 221004)

藥物治療是惡性腫瘤治療的重要方法之一.傳統的抗腫瘤化療藥物靶向性差，毒副作用大，患者耐受性差，很大程度上制約了其臨床應用[1-2]，而納米粒給藥系統由于其獨特的尺寸性質和分子結構，可將藥物靶向輸送到指定的腫瘤部位，提高局部藥物濃度，增強殺傷能力，所以在腫瘤治療領域中已成為國內外研究者最關注的熱點之一[3-5].小分子熱休克蛋白(sHSP)具有球狀籠形空心結構，其內部空腔可作為藥物的載庫[6]，且其內、外表面都有豐富的可修飾位點[7]，因此可通過基因工程或化學手段進行改造使其具有理想的性能與更多的功能[8-9].

通過前期研究自行設計并構建了載紫杉醇(PTX)的pH敏感型HSP納米載體(PT-HSP).該載體以籠形蛋白HSP作為載藥內核，穿膜肽Tat通過戊二醛接枝到HSP表面得T-HSP，最外層為對pH敏感的聚磺胺嘧啶/聚乙二醇丙烯酸共聚物(PSPA)通過靜電相互作用與T-HSP結合，制備得到Tat/PSPA修飾的PT-HSP[10].利用體內腫瘤部位的pH比正常組織略低的生理特性[11-12]，可使PT-HSP在生理pH條件下包衣化而在腫瘤pH條件下去包衣化.通過這種pH敏感的轉變使Tat在正常組織被掩蓋而在腫瘤組織被暴露，實現腫瘤靶向性.為進一步闡明PT-HSP智能納米遞藥載體進入腫瘤細胞的過程和作用，本研究將載PTX的PT-HSP分別與兩種腫瘤細胞共孵育，觀察藥物入胞情況，探究其影響因素及入胞機制，綜合評價其細胞殺傷能力，并分析其生物相容性，以期為靶向腫瘤細胞的納米給藥系統提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥品及試劑

聚乙二醇2000(PEG-2K,西隴化工公司),聚乙二醇4000(PEG-4K,國藥集團化學試劑有限公司),聚乙二醇6000(PEG-6K,南京化學試劑公司),重組嗜熱古細菌(Methanococcusjannaschii)HSP、穿膜肽Tat(上海生工生物工程公司，純度>85%),PTX(西安昊軒生物科技公司，純度98.5%)，二甲基亞砜(DMSO,西隴化工公司)，異硫氰基熒光素(FITC，上海阿拉丁試劑公司)，樹脂天青(上海阿拉丁試劑公司，純度≥90%)，秋水仙堿(日本東京化成工業株式會社)，制霉菌素(美國BIOSHARP公司)，鹽酸氯丙嗪(CPZ，日本東京化成工業株式會社)，莫能星鈉(上海源葉生物科技公司)，疊氮化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，臺盼藍(K940，南京凱基生物科技公司，質量分數0.4%)，RIPA裂解液(南京凱基生物科技公司)，胎牛血清(特級，浙江天杭生物科技股份有限公司).

1.1.2 儀 器

F4500熒光分光光度計、UV-2450紫外-可見分光光度計(日本日立公司),冷凍干燥機(FD-1C-50，日本島津公司),低速離心機(5702，北京博醫實驗儀器公司),倒置顯微鏡(CKX31，德國Eppendorf公司),倒置熒光顯微鏡(U-REL-T、TH4-200、TX2-ILL100，日本奧林巴斯公司).

1.1.3 細胞株、培養基和實驗動物

倉鼠肺成纖維細胞CHL、人肺癌細胞A549、人宮頸癌細胞HeLa(中國科學院上海細胞庫)，DMEM(高糖)培養基、RPMI-1640培養基(南京凱基生物科技公司)，普通級兔(徐州醫科大學實驗動物中心).

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養

CHL和HeLa細胞采用DMEM培養基，A549細胞采用RPMI-1640培養基,均含10%(體積分數)胎牛血清并添加1%(體積分數)雙抗(80 U/mL青霉素和0.08 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養基，在37 ℃、5%(體積分數)CO2細胞培養箱中培養.

1.2.2 細胞攝取影響因素實驗

稱取4.0 mg Tat溶于5 mL DMSO中，按摩爾比1∶2加入1.6 mg FITC，37 ℃下攪拌反應12 h，將混合液裝入透析袋并置于去離子水中透析，4 h更換一次透析液，透析24 h.透析液經凝膠滲透層析柱(Sephadex G50，美國Pharmacia公司)分離游離的FITC，收集FITC標記的Tat(即FITC-Tat)，進一步制得FITC標記的T-HSP與PT-HSP[10].

取對數生長期的CHL細胞以1×105/孔置于24孔板培養24 h.棄去原有培養基，更換為pH 7.4的無血清DMEM培養基.分別選擇PEG-2K、PEG-4K和PEG-6K制備的PT-HSP，向每孔中加入200 μg/mL按上述方法制備所得FITC標記的T-HSP與PT-HSP，37 ℃，100 r/min共孵育4 h.用倒置熒光顯微鏡拍攝其入胞情況.用RIPA裂解液裂解細胞20 min，3 000 r/min下室溫離心10 min，取上清用熒光分光光度計檢測FITC的熒光強度(激發波長450 nm，發射波長520 nm，狹縫寬度5 nm)，以T-HSP為對照，分析不同相對分子質量的PSPA對細胞攝取的影響.

參照上述步驟，采用PEG-6K制備的PSPA,按n(HSP亞基)∶n(PSPA)=1∶1，1∶2，1∶3(下文稱投料比)分別制備PT-HSP.以T-HSP為對照，分析不同投料比對細胞攝取的影響.

1.2.3 體外細胞攝取實驗

取對數生長期的CHL、A549和HeLa細胞，以1×105/孔置于24孔板培養24 h.棄去原有培養基，CHL細胞更換為pH 7.4的無血清DMEM培養基，A549和HeLa細胞更換為pH 6.5的無血清培養基.然后向每孔中加入200 μg/mL FITC標記的T-HSP與PT-HSP，37 ℃、100 r/min共孵育4 h.倒置熒光顯微鏡下拍攝其入胞情況.

1.2.4 細胞殺傷實驗

取對數生長期的CHL細胞，以1×105/孔置于24孔板培養24 h.棄去原有培養基，更換為pH 7.4(生理pH條件)的無血清DMEM培養基.按50和25 μg/mL的PTX實際質量濃度，分別將PTX的DMSO溶液、載PTX的T-HSP及載PTX的PT-HSP加入培養孔中，每個濃度3個平行孔，加藥后繼續培養24 h.

取對數生長期的HeLa和A549細胞，以5×104/孔置于96孔板培養24 h.棄去原有培養基，更換為pH 6.5(腫瘤pH條件)的無血清培養基.按0.5，1.0，2.0，5.0，10，15，25，50 μg/mL的PTX實際質量濃度，分別將PTX的DMSO溶液和載PTX的T-HSP加入培養孔中，每個濃度3個平行孔，加藥后繼續培養24 h.

培養的細胞棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，24和96孔板各孔分別加入200和100 μL胰酶消化細胞.待細胞完全懸浮后加200和100 μL培養基終止消化，吸取各孔液體，置于1.5 mL離心管中1 500 r/min離心3 min，棄去上清液，加入400和200 μL 0.04%(質量分數)臺盼藍溶液，小心混勻，取10 μL用細胞計數板在顯微鏡下計數.以不給藥組的細胞數為對照，計算各給藥組的細胞存活率.

1.2.5 生物安全性評價

1) 細胞毒性檢測

按1.2.4小節中的方法取CHL細胞并更換培養基，分別將HSP、T-HSP及PT-HSP按1 500，750，325，160，80，40 μg/mL的質量濃度加入培養孔中，每個濃度3個平行孔.加藥后繼續培養24 h.培養的細胞棄去培養基，用PBS沖洗3遍后，按100 μg/mL加入樹脂天青溶液[13]，繼續培養2 h.然后將培養液稀釋100倍后用熒光分光光度計測定熒光強度，以不加載體組的熒光強度為對照，計算不同載體組在各濃度下的細胞存活率.

2) 溶血試驗

抽取普通級兔新鮮血液15 mL，加入適量肝素，1 500 r/min離心5 min收集紅細胞.用PBS清洗3遍后棄去上清，配制成2.5%(體積分數)的紅細胞懸液.分別配制20 mg/mL T-HSP和PT-HSP納米混懸液，各取0.1，0.2，0.4 mL，用PBS定容至2 mL.另取2 mL PBS和去離子水，分別加入2 mL紅細胞懸液，充分混勻，其中PBS組作為陰性對照組，去離子水組作為陽性對照組.在37 ℃恒溫振蕩培養箱中孵育 1 h，3 000 r/min離心10 min，分別用T-HSP與PT-HSP混懸液作為空白對照，在541 nm處測定上清的吸光度，計算溶血率(hemolysis ratio，RH)：

RH=(A樣品-A陰性對照)/(A陽性對照-A陰性對照)×100%.

1.2.6 細胞攝取機制分析

取對數生長期的A549細胞，以1×105/孔置于24孔板培養24 h.棄去原有培養基，更換為pH 6.5的無血清RPMI-1640培養基.分別加入不同的細胞攝取抑制劑CPZ(10 μg/mL)、秋水仙堿(50 μg/mL)、疊氮化鈉(1 mg/mL)、制霉菌素(6 μg/mL)及莫能星鈉(2 μg/mL)，37 ℃、100 r/min共孵育30 min.再向每孔中加入200 μg/mL FITC標記的PT-HSP，37 ℃、100 r/min繼續孵育2 h.用RIPA裂解液裂解細胞20 min，3 000 r/min離心10 min，取上清用熒光分光光度計檢測FITC的熒光強度，以不加抑制劑的單純載體組為對照，比較各抑制劑的作用強度，分析PT-HSP的入胞機制.

1.2.7 統計學分析

所有實驗數據以平均值±標準差表示，利用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異中等顯著，p<0.001 表示差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 細胞攝取的影響因素

2.1.1 不同相對分子質量的PSPA

如圖1所示：PEG-2K和PEG-4K組的入胞情況較好，而PEG-6K組熒光在胞內分布明顯減少，且與PEG-2K、PEG-4K組的細胞攝取率有極顯著差異，表明只有具有長鏈PEG的PSPA包衣層才可以顯著抑制CHL細胞對PT-HSP的攝取.

(a) 顯微觀察結果;(b) 數據統計分析：*，* *，* * *分別

圖1 PSPA相對分子質量對PT-HSP入胞的影響

Fig.1 Effects of the relative molecular masses of PSPA on PT-HSP enterance into cells

2.1.2 不同投料比

如圖2所示:PT-HSP的入胞情況與T-HSP相比，投料比為1∶1時無顯著差異，而投料比為1∶2和1∶3時細胞攝取率均有極顯著減小，表明其抑制入胞作用顯著強于投料比為1∶1時.

* * *表示與T-HSP組比較，p<0.001.圖2 HSP亞基與PSPA投料比對PT-HSP入胞的影響Fig.2 Effects of the ratios of HSP subunit to PSPA on PT-HSP entrance into cells

細胞攝取影響因素實驗結果表明，當投料比超過1∶2且PEG相對分子質量較大(6 000)時，PSPA包衣可完全掩蓋Tat，對PT-HSP進入正常細胞有明顯抑制作用.故后續均采用投料比1∶2且PEG相對分子質量為6 000的PT-HSP進行實驗.

2.2 不同細胞的體外攝取差異

為探究正常細胞和腫瘤細胞對PT-HSP的攝取情況，將T-HSP和PT-HSP分別與CHL、A549和HeLa細胞共培養.從圖3可見：T-HSP在生理pH條件下培養的CHL細胞中有一定的分布，而PT-HSP基本不入胞.T-HSP可被腫瘤pH條件下培養的A549和HeLa細胞大量攝取，而PT-HSP在同樣條件下也可被細胞攝取，且熒光強度與攝取T-HSP的細胞相比未見減弱.上述結果表明PT-HSP能被A549和HeLa兩種腫瘤細胞大量攝取，而被正常CHL細胞攝取得極少，體現出良好的體外腫瘤細胞靶向性.

圖3 T-HSP和PT-HSP被正常細胞和腫瘤細胞攝取的情況Fig.3 Uptake of T-HSP and PT-HSP by normal and tumor cells

2.3 細胞殺傷的選擇性

為確認載PTX的PT-HSP對正常細胞和腫瘤細胞具有高選擇性殺傷能力，采用臺盼藍染色法進行驗證.如圖4(a)所示，在CHL細胞中，載PTX的PT-HSP組細胞存活率極顯著高于PTX注射液組和載PTX的T-HSP組.由于PT-HSP在腫瘤pH條件下會去包衣化暴露Tat，所以只分析載PTX的T-HSP在相同PTX濃度下對腫瘤細胞的殺傷作用.如圖4(b)和(c)所示，在A549和HeLa細胞中載PTX的T-HSP組細胞存活率均顯著低于PTX注射液組.可見載PTX的T-HSP對腫瘤細胞和正常細胞均有較強殺傷作用；而載PTX的PT-HSP對正常細胞傷害較小，對腫瘤細胞則具有較強殺傷作用，說明經PSPA包衣化的載PTX的PT-HSP能更好地選擇性殺傷腫瘤細胞.

圖4 PTX與載PTX的納米載體對CHL(a)、A549(b)和HeLa(c)細胞的殺傷作用Fig.4 Cell killing effects of PTX and PTX-loaded nano-carriers on CHL (a),A549 (b) and Hela (c) cells

2.4 生物安全性分析

2.4.1 細胞毒性

如圖5所示，在40～750 μg/mL的質量濃度下，不同載體對細胞活性均無顯著影響，僅當T-HSP的質量濃度高達1 500 μg/mL(遠超其使用濃度)時才對CHL細胞產生顯著影響，而HSP與PT-HSP在高濃度時仍對CHL細胞活性無顯著影響，表明這三者在正常使用時對CHL細胞均不會產生毒性，其中PT-HSP的安全性優于T-HSP.

圖5 HSP、T-HSP、PT-HSP對CHL細胞的毒性Fig.5 Cytotoxicity of HSP,T-HSP,PT-HSP to CHL cells

2.4.2 體外溶血率

如圖6所示，分析載體質量濃度分別為0.5，1.0和2.0 mg/mL時的體外溶血率，T-HSP分別為(1.2±0.7)%，(2.6±0.5)%和(4.9±0.8)%，PT-HSP分別為(0.7±0.2)%，(1.2±0.4)%和(1.6±0.5)%，可見體外注射PT-HSP的溶血率低于5%，不會引起溶血[14]，表明PT-HSP具有良好的生物安全性.

* *表示與T-HSP組比較，p<0.05.圖6 T-HSP和PT-HSP的溶血試驗Fig.6 Hemolysis assay of T-HSP and PT-HSP

2.5 細胞攝取機制

細胞內吞主要有網格蛋白介導的內吞、小窩蛋白介導的內吞、巨胞飲以及網格蛋白和小窩蛋白非依賴的內吞4種機制[15].為分析PT-HSP進入腫瘤細胞的內吞方式，選用5種不同的抑制劑：疊氮化鈉抑制ATP酶，CPZ封閉網格蛋白有被小泡，莫能星鈉阻斷網格蛋白受體的循環利用，制霉菌素抑制小窩蛋白，秋水仙堿抑制微管蛋白從而阻斷細胞的巨胞飲作用.各抑制劑的加入對PT-HSP入胞情況的影響如圖7所示：疊氮化鈉具有最強的抑制作用，細胞攝取率僅為(2.4±0.5)%;其次為秋水仙堿和制霉菌素，細胞攝取率分別為(35.1±8.7)%和(50.4±1.4)%;而CPZ和莫能星鈉的抑制作用不顯著.

* * *表示與未加抑制劑的單純載體組比較，p<0.001.圖7 細胞攝取抑制劑對PT-HSP入胞的影響Fig.7 Effects of inhibitors of cellular uptake on PT-HSP enterance into cells

上述結果表明PT-HSP主要通過依賴能量的巨胞飲方式和小窩蛋白介導的內吞方式進入A549細胞，可見Tat在PT-HSP的入胞過程中起主導作用.

3 結 論

本研究基于前期構建的PT-HSP，對其在腫瘤細胞中的攝取特性、藥理學活性和細胞攝取機制進行探究.結果表明載PTX的PT-HSP體外腫瘤靶向性能較好，相比于PTX和載PTX的T-HSP能更好地選擇性殺傷腫瘤細胞，同時減少對正常細胞的傷害，且生物安全性良好.綜上所述，PT-HSP作為一種新型腫瘤藥物靶向遞送載體，既實現了增強抗腫瘤藥的效果，又減少了其毒副作用，具有廣闊的應用前景.