鎖核酸修飾探針熔解曲線分析在Kras基因突變檢測中的應用

倪潤芳，黃秋英，錢思雨，李騰文，蘇國強*，李慶閣*

(1.廈門大學生命科學學院，分子診斷教育部工程研究中心，福建 廈門 361102；2.廈門大學附屬第一醫院胃腸外三科，福建 廈門 361005)

近年來，對化療無效的結直腸癌患者治療研究中，在表皮生長因子受體(EGFR)靶向藥物治療方面取得重大進展，顯著改善了轉移性結直腸癌患者的存活率[1].結直腸癌患者中Kras基因突變率為35%～40%[2]，其中90%的突變發生在外顯子2的密碼子12和13上[3](密碼子12上發生頻率為70%，密碼子13上的發生頻率為30%)，而極少發生在密碼子61和63上.美國綜合癌癥網絡(NCCN)將Kras突變檢測列入結直腸癌患者常規檢測項目，并明確指出必須進行密碼子12和13上突變的檢測，其中常見的7種熱點突變及其發生頻率見表1.結直腸癌患者發生任何一種上述類型的Kras突變均表現為對EGFR靶向藥物的耐受[4].因此，準確檢測Kras突變有十分重要的臨床意義.

腫瘤基因突變是發生在實體瘤中的體細胞突變，表現為混雜有大量野生型基因組的低含量突變，故稱為稀有突變.近年來，利用外周血循環腫瘤DNA(ctDNA)[5-7]進行腫瘤稀有突變無創檢測成為熱點，而ctDNA中突變率更低，一般低于0.5%[8].因此，必須提高稀有突變檢測方法的靈敏度.目前，有多種針對Kras突變的檢測方法，主要包括等位基因特異性PCR(AS-PCR)、擴增阻礙突變系統(ARMS)、高分辨率熔解分析(HRM)、低溫變性共擴增PCR(COLD-PCR)、下一代測序(NGS)以及基于小珠、乳濁液、擴增、磁性的數字PCR-流式技術(BEAMing)和數字PCR(dPCR)等.然而這些方法的分析靈敏度大多有限(1%～5%)，難以檢測低豐度的Kras突變[9].雖然BEAMing[10]和dPCR[11]方法的分析靈敏度較高，可達0.1%左右，但是因為操作繁瑣且檢測成本較高，在臨床上的應用有限.基于以上研究現狀，臨床上迫切需要更加簡便、價廉、靈敏度高的檢測方法用于檢測低豐度的Kras突變.

表1 Kras的7種常見突變類型及其發生頻率

注：c表示cDNA參考序列;p表示蛋白參考序列;34,35,38表示堿基在Kras基因序列中的位置.*來自于Cosmic數據庫.

探針熔解曲線分析(MCA)是PCR后的產物分析技術[12]，利用探針與不同靶序列雜交后形成的雙鏈DNA熔點差異來區分不同靶序列，方法簡捷，且閉管操作可防止樣本交叉污染，但其靈敏度一般在5%～10%.近年來，有多種DNA和RNA的類似物用于科學研究，其中鎖核酸(LNA)的應用引起了廣泛關注.LNA是一種核苷酸衍生物[13]，和普通核苷酸分子的區別在于其碳環的2′-O和4′-C位置引入了亞甲基橋而形成鎖狀結構.LNA與DNA/RNA結合時遵循Watson-Crick堿基互補配對原則，且LNA的雜交親和性遠高于相應的DNA-DNA或RNA-RNA[14].據Wahlestedt等[15]報道，因為LNA和DNA的結合導致構象發生一定程度的改變，所以含有LNA堿基的寡核苷酸更能耐受核酸酶的作用，不易被降解.LNA不僅與DNA的親和度高，而且對堿基錯配的敏感性高，因此可顯著增大完全匹配雙鏈與堿基錯配雙鏈間的熱穩定性差異，適合用于點突變檢測.

本研究使用LNA修飾探針和MCA技術進行Kras突變富集檢測，旨在建立一種簡捷、高靈敏度的突變檢測方法，用于指導腫瘤患者個體化用藥，推進分子診斷技術在精準醫療等方面的臨床應用.

1 材料與方法

1.1 材 料

293T細胞系不含Kras突變，作為野生型基因組標準品.采用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德國)進行基因組DNA提取.

結直腸癌標本為冰凍組織標本，由廈門大學附屬中山醫院提供.冰凍組織標本經手術切除后立即被分裝成小塊保存于液氮或-80 ℃冰箱中，提取前切取米粒大小的組織，使用TIANamp組織/細胞/血液全基因組DNA提取試劑盒(天根生物有限公司，北京)進行提取.

以上提取獲得的DNA樣本用Spectrophotometer ND-1000(Nanodrop，美國)測定吸光度，檢測提取質量和濃度，剩余樣本置于-20 ℃冰箱保存備用.

1.1.2 突變型質粒

使用重疊延伸法構建突變型質粒，包括表1中的7種熱點突變.使用小量質粒提取試劑盒(Omega，美國)提取質粒，使用BamH Ⅰ酶(TaKaRa，大連)酶切，經瓊脂糖凝膠電泳切膠獲得對應長度的目的片段，用膠回收試劑盒(Omega，美國)純化得到線性質粒，用Spectrophotometer ND-1000測定質粒DNA的濃度，根據濃度及質粒片段大小計算出對應拷貝數，梯度稀釋后置于-20 ℃冰箱保存備用.

1.1.3 引物和探針

通過NCBI數據庫查詢公布的Kras序列，查找到相關序列并標出單核苷酸多態性(SNP)位點，在后續的引物和探針設計過程中保證引物探針位置不覆蓋SNP位點，以免影響擴增效率或雜交效率.

由于所檢測的7個突變集中在密碼子12和13上，設計一條探針即可全部覆蓋.為了增強探針對野生型和突變型的區分度，依據反義序列設計探針，使探針與野生型完全匹配.使用TmUtility v1.3軟件預測探針與野生型和突變型雜交雙鏈的Tm值，保證兩者的ΔTm大于5 ℃.使用The Mfold Web Server(http:∥mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)進行二級結構分析，保證設計的改良分子信標僅存在一種穩定的莖環結構，分析條件為Na+濃度50 mmol/L、Mg2+濃度3.0 mmol/L、折疊溫度55 ℃.未修飾的探針設計完成后，結合Kras突變特點進行LNA修飾，7個熱點突變發生在密碼子12和13的3個堿基G位點上，對這3個位點的核苷酸進行LNA修飾.通過LNA TM Oligo Tools(https:∥www.exiqon.com/oligo-tools)預測修飾LNA后探針的Tm值.

綜上所述，在抑制HeLa細胞中的GRIM-19基因表達后，細胞的存活及抗凋亡作用能力顯著降低，提示GRIM-19基因對腫瘤細胞起到了保護作用。深入研究GRIM-19基因在子宮頸癌中的表達和意義將會為今后的臨床治療和防治提供重要的理論基礎。

探針設計完成后，使用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0和TmUtility v1.3軟件在探針兩側設計引物.將設計好的引物和探針通過BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對，保證其擴增和檢測的特異性.引物和探針均由上海生物工程有限公司合成，相應序列見表2.

表2 MCA-LNA體系所用引物和探針

注：“+”后的堿基表示其被相應的LNA替代.

1.2 方 法

1.2.1 人工合成靶序列MCA考察探針

人工合成的靶序列是一段與探針互補的寡核苷酸，比探針長約4～8 bp，用于考察探針的區分能力和評價LNA修飾對探針Tm值和ΔTm的影響.合成的8條靶序列如表3所示.

表3 本研究所用的人工合成靶序列

注：下劃線標記位置為突變位點.

探針與人工合成靶序列的MCA體系(25 μL)如下：1×PCR緩沖液、0.2 μmol/L探針、0.4 μmol/L靶序列或無菌水(陰性對照).MCA程序為：95 ℃變性1 min，35 ℃保溫5 min，隨后按照每步0.2 ℃的升溫速率從40 ℃遞增至95 ℃，升溫過程中采集ROX通道的熒光信號.實驗在LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)上進行.

1.2.2 MCA-LNA體系的建立

MCA-LNA體系(25 μL)如下：1×PCR緩沖液、5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.5 UTaqHS(TaKaRa，大連)、0.4 μmol/L上游引物、0.04 μmol/L下游引物、0.2 μmol/L探針和5 μL DNA模板.PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min;循環周期為95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，78 ℃ 10 s，共60個循環.PCR反應結束后進行探針MCA，分析程序與1.2.1小節中相同.

1.2.3 體系的分析靈敏度考察

靈敏度為在一定量野生型背景下能夠檢測到的突變模板含量.3.3 pg人類基因組DNA相當于1個拷貝[16]，即10 ng相當于3×103個拷貝.考察MCA-LNA體系的分析靈敏度時，使用相同濃度(6×103拷貝/μL)的突變型質粒DNA和野生型基因組DNA按不同比例混合，形成一系列混合模板，突變型比例分別為50%，10%，5%，1%，0.5%，0.1% 和0.05%.

1.2.4 結直腸癌臨床標本檢測

通過對72份結直腸癌臨床冰凍組織標本的檢測，考察MCA-LNA體系的準確性和臨床適用性.同時采用MCA體系、直接測序和本研究前期建立的ARMS[17]作為對照方法對臨床標本的檢測結果進行驗證.

2 結果與分析

2.1 MCA-LNA體系檢測原理

MCA技術檢測突變的原理如下：當探針設計與野生型序列完全匹配時，探針與野生型擴增子形成完全匹配且穩定的雙鏈產物，產生Tm值較高的熔解峰；而探針與突變型擴增子會產生單堿基錯配，形成穩定性較差的雙鏈產物，產生Tm值較低的熔解峰.MCA-LNA檢測體系采用LNA修飾探針進行MCA,與MCA體系檢測原理類似:由于完全匹配的DNA-LNA雙鏈穩定性顯著高于DNA-DNA雙鏈，所以探針與野生型模板形成穩定的雙鏈結構，在延伸階段也可穩定結合，導致引物難以延伸，從而起到抑制野生型模板擴增的作用；而探針與突變型模板間有單堿基突變，相對于DNA-DNA雙鏈，DNA-LNA雙鏈存在錯配會更大程度地降低雙鏈穩定性，在延伸階段探針可以解鏈，使得突變型模板的擴增不受影響，以此達到富集突變型模板的目的.

2.2 靶序列的MCA考察

靶序列的熔解曲線如圖1(a)和(b)所示：探針與野生型模板完全匹配，所得雙鏈產物的Tm值最高；探針與7個突變型模板均有一個堿基錯配，所得雙鏈產物的Tm值較低，且探針在LNA修飾前后均可達到區分野生型和突變型的目的.不同模板對應的Tm值如圖1(c)所示，可見LNA修飾探針后，7種突變型和野生型模板的Tm值均得到明顯提升，提升幅度在7～10 ℃.探針熔解曲線的區分能力取決于野生型與突變型的ΔTm值.如圖1(d)所示，LNA修飾后探針的ΔTm提高約1～4 ℃,由此可見LNA修飾能提升探針的區分能力.

(a)和(b)分別為MCA-LNA和MCA體系的探針與靶序列的熔解曲線，WT為野生型對照，NTC為無模板對照，MUT為突變型模板，F表示熒光強度(下同)；(c)野生型與不同突變型的Tm值對比；(d)不同突變型與野生型之間的ΔTm值對比.圖1 靶序列的MCAFig.1 MCA of target sequences

2.3 分析靈敏度的考察

MCA-LNA體系的靈敏度考察結果如圖2所示:靈敏度標準品由于混有野生型和突變型2種模板，所以會有2個不同Tm值的熔解峰;以突變型峰的有無作為判讀依據，MCA-LNA體系的分析靈敏度可達0.05%～0.5%.由此可見MCA-LNA體系具有良好的檢測靈敏度，更適用于腫瘤的稀有突變檢測.

2.4 臨床標本檢測

MCA-LNA體系檢測結直腸癌標本的結果顯示，72份標本中檢測出24份陽性，突變率為33.3%，與文獻[18-19]報道的突變率一致.

典型臨床標本的檢測結果如圖3所示：其中33號和51號標本經測序檢測均為突變型，且51號標本中突變型的比例較33號的低，用MCA體系檢測時，突變型比例較高的標本，其突變信號峰也較高，而MCA-LNA體系對這2份標本檢測的突變型信號峰均更明顯；對于67號標本，測序和MCA體系均未檢出突變型，但MCA-LNA體系檢測時有較低的突變型信號峰，說明MCA-LNA體系更有利于低比例突變型標本的檢測.

全部標本的檢測結果見表4.由于測序的靈敏度只能達到15%～20%，檢測標本時容易造成假陰性，24份陽性標本中測序僅檢測到15份突變陽性；MCA體系檢測時，相比MCA-LNA體系少檢出5份陽性標本，其余檢測結果完全一致；ARMS檢測時，檢測到26份突變陽性標本，相比MCA-LNA體系多檢出2份G12V陽性標本(10號和18號)，分析其檢測結果不一致的原因為ARMS對該位點的檢測靈敏度(0.01%)略高于MCA-LNA體系對該位點的靈敏度(0.05%)，當樣本中突變型比例在0.05%以下時，MCA-LNA在該位點可能存在突變型標本漏檢的情況.

圖2 MCA-LNA體系的分析靈敏度Fig.2 Analytical sensitivity of MCA-LNA assay

圖3 典型臨床標本的檢測結果Fig.3 Detection results of typical clinical samples

以上結果說明標本檢出的突變陽性率與分析靈敏度的高低有關，MCA-LNA體系的探針經LNA修飾后提升了檢測的靈敏度，從而提高了突變陽性標本的檢出率.

3 討論與結論

Kras突變檢測對結直腸癌患者的個體化治療有非常重要的作用.然而Kras突變屬于實體瘤中體細胞的稀有突變，對現有檢測方法造成了技術瓶頸，因此要求檢測的靈敏度必須得到很大程度的提升，以避免檢測結果出現假陰性，提高稀有突變的檢出率.

表4 不同方法的樣本檢測結果

注：WT.野生型；MUT.突變型.

LNA對DNA的親和性高且區分度良好，在PCR反應過程中不會被DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性所影響，可以富集突變型，提高體系的靈敏度.目前LNA技術已被廣泛應用于低豐度突變的檢測中，利用與野生型完全匹配的LNA修飾的寡核苷酸鏈作為阻抑子阻礙野生型模板的擴增，可實現對突變型模板的富集.例如利用LNA技術對低豐度突變富集后測序[20-21]，靈敏度達到約1%，富集能力達到普通MCA體系的約20倍；利用LNA技術結合實時熒光定量PCR檢測[22-24]時，在PCR反應體系中同時加入LNA阻抑子和熒光檢測探針，靈敏度約為0.1%.本研究對MCA體系中的熒光雙標記自淬滅探針進行LNA修飾，使探針同時作為阻抑子和檢測探針，既在擴增階段達到阻抑野生型和富集突變型的目的，又在MCA時作為檢測探針對多種突變型與野生型進行區分，體系的靈敏度可達0.05%～0.5%，與普通MCA體系相比，LNA修飾后體系的突變富集能力可達10～100倍.

MCA-LNA體系存在的缺點是無法區分Kras突變的類型，但由于Kras多種突變類型對EGFR靶向藥物都是耐藥的，所以不會影響耐藥情況的判斷.近年來有研究顯示，含有不同Kras突變的患者可能會有不同的臨床反應：若攜帶有KrasG12D突變，則可能發生造血系統的轉移[25]；若發生Kras密碼子13的突變，同時MACC1基因高表達，則患者生存期會減短[26]；若發生KrasG12C或G13D突變，則預后會變差[27].這些研究說明Kras突變類型的區分也是有意義的，但目前還未得到廣泛認證.若檢測中需要進行突變類型的確認，可將MCA-LNA體系的擴增產物進行測序驗證，輔助判讀.

綜上，本研究以MCA體系為基礎，結合LNA修飾探針技術建立了MCA-LNA體系.與普通MCA體系相比，通過探針的改良達到了富集突變型的效果，提高了分析靈敏度，實現一管反應中同時檢測Kras密碼子12和13上的7個熱點突變.此方法判讀簡單，檢測成本較低，具有良好的臨床推廣潛力.