白及主要活性成分Militarine對斑馬魚胚胎發育的安全性評價*

陳 浩，劉 慧，鄭 林，李月婷，李勇軍，鞏仔鵬，黃 勇，劉麗娜

（貴州醫科大學·貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室·民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004）

白及為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.的干燥塊莖，又名連及草、紫蘭等，最早見于《神農本草經》，1963年后收藏于各個版本的《中藥藥典》，野生品主產于貴州、四川等地［1］。白及具有收斂止血、消腫生肌之功效，臨床主治咯血、吐血、肺結核咳血、外傷出血、潰瘍疼痛、湯火灼傷、皮膚皸裂和瘡瘍腫毒等，療效顯著［2］。Militarine為白及中含量較高的活性成分，在白及藥材中的含量為 1.45% ～ 3.32%［3］。Mili-tarine能改善慢性腦缺血大鼠的認知功能障礙，減輕腦白質缺血性損傷，舒張血管［4］。模式生物斑馬魚近年來成為藥物評價和毒性篩選的首選模型［5-6］。作為一種脊椎動物模型，斑馬魚與人類基因相似度高達87%［7-8］，且具有完整的組織器官，其胚胎及幼魚對大多數藥物的反應與人類臨床反應相似［9-10］。斑馬魚胚胎在母體外發育，發育時間短，數量大，早期胚胎透明，可直接在顯微鏡下觀察各組織臟器的形態變化及血液流動情況，能極大地彌補體內試驗與體外試驗之間的間隙［11］。本研究中選擇以斑馬魚胚胎為模型，研究白及主要活性成分Militarine對斑馬魚胚胎發育的毒性作用，為Militarine的創新藥物研發、臨床安全用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：奧林巴斯CX41RF型電子顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；DH6000BⅡ型電熱恒溫培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AE240電子天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）；超聲波清洗器（功率為250W，頻率為27～34 kHz，北京醫療設備二廠）；微量移液器（德國Eppendorf股份公司）。

試藥與動物：Militarine對照品（批號為ps171128-04，含量≥98%，成都普思生物科技股份有限公司）；德國Tubingen野生型斑馬魚胚胎，由貴州醫科大學基礎醫學院斑馬魚平臺提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

Militarine貯備液：稱取Militarine適量，溶于斑馬魚培養液（0.06 g/L海鹽、亞甲基藍）中，超聲溶解，配成5 g/L的貯備液，置4℃冰箱中儲存。

Militarine樣品溶液：根據預試驗結果，用培養液將貯備液稀釋至 0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L，作為 Militarine溶液組。

Militarine樣品溶液處理斑馬魚胚胎：除去未受精卵、糞便、死胎等雜物，置28℃恒溫培養箱中孵育至受精后6 h，選取正常發育的胚胎，轉入含有2.5 mL不同質量濃度（0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L）的 Militarine 溶液（12 孔板），每孔分別放入24枚受精卵，每個質量濃度設置3個平行組且設空白對照組。將挑選好的胚胎放入28℃恒溫培養箱中培養，每隔24 h更換1次溶液，試驗過程中應及時將死亡的胚胎挑出，以防對其余胚胎產生影響。

1.2.2 檢測指標

Militarine對斑馬魚胚胎發育的影響：以斑馬魚胚胎培養液中發育的胚胎為空白對照組，通過電子顯微鏡分別于 24，48，72，96，144 受精后小時（hpf）時間點觀察各胚胎的形態變化與發育情況，并詳細記錄，統計不同時間終點的死亡數、畸形數，并拍照記錄狀態。

斑馬魚胚胎 48 hpf心率［12］：記錄 48 hpf胚胎 10 s內心率，每一質量濃度下隨機取6枚胚胎進行統計。

斑馬魚胚胎孵化率［12］：分別選擇 48，72，96 hpf統計胚胎的孵化率。統計應用Militarine后斑馬魚胚胎的孵化率。孵化率（%）=每孔已孵化胚胎/每孔總胚胎個數×100%。

斑馬魚死亡率和畸形率［13］：分別于 72，96，144 hpf時統計胚胎的畸形和死亡情況。畸形率（%）=（畸形數+死亡數）/胚胎總數×100%，死亡率（% ）=死亡數/胚胎總數×100%。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析。試驗結果用表示，組間采用單因素方差分析比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對斑馬魚胚胎發育的影響

6 hpf開始用含不同質量濃度的Militarine溶液孵育斑馬魚胚胎后，觀察了24～144 hpf期間5個時間點不同質量濃度Militarine溶液組及空白對照組斑馬魚胚胎不同發育階段的形態變化。Militarine各組斑馬魚胚胎出現不同程度的畸形。同一時間點，劑量越大畸形情況越嚴重；同一濃度下，隨著時間的延長畸形情況越嚴重。畸形主要表現為心包囊水腫、尾部和脊柱彎曲、卵黃囊水腫及色素沉積、頭部和眼部發育不良。Militarine對斑馬魚胚胎72 hpf形態發育的影響見圖1。

圖1 Militarine對斑馬魚胚胎72 hpf形態發育的影響

2.2 對斑馬魚胚胎檢測指標的影響

結果見表1。隨著溶液濃度的增加，斑馬魚胚胎的尾部自主抽動次數越少，在Militarine質量濃度為3.2 g/L組中，斑馬魚胚胎未出現尾部自主抽動情況。隨著質量濃度的增加，斑馬魚胚胎的心率變緩。

表1 Militarine對斑馬魚胚胎檢測指標的影響（ ± s，n=6）

表1 Militarine對斑馬魚胚胎檢測指標的影響（ ± s，n=6）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表 2同。

質量濃度（g/L）0（空白對照組）0.025 0.050 0.100 0.200 0.400 0.800 1.600 3.200 24 hpf尾部自主抽動次數（次/分）14.67±1.21 14.00 ±0.89 13.17±1.17 12.33 ±0.82 11.00 ±1.41*9.50±0.55**9.17 ±1.17**5.67±1.03**0.00±0.00**48 hpf心率（次 /10 s）13.67±0.52 12.67 ±1.03 12.00±1.41 9.17 ±0.75**8.67 ±0.52**8.00±0.89**7.67 ±1.03**7.33±0.82**5.67±1.03**48 hpf 5.56±2.44 9.72 ±2.41 13.89±2.41*26.39±6.37**34.72 ±4.81**26.39±2.41**22.22±6.37**12.50±4.17 6.94±2.40孵化率（%）72 hpf 62.50±4.17 63.89 ±8.67 72.22±6.37*76.39 ±2.41**80.56 ±6.36**75.00±4.17*69.44 ±6.36 61.11±4.81 51.39±2.41*96 hpf 98.61±2.41 97.22 ±2.41 94.44±6.36 97.22±2.41 91.67 ±4.17 83.33±8.33**79.17±4.17**75.00±8.33**65.28±6.36**

2.3 對斑馬魚胚胎不同時間段死亡率和畸形率的影響結果見表2。

3 討論

斑馬魚早期胚胎透明，在顯微鏡下可清晰觀察整體動物多個主要器官的發育情況［14］，具備整體評價藥效學及藥動學、代謝活性等優勢，斑馬魚生物模型便于檢測分析中藥毒性［15］。

本研究結果表明，在24 hpf前，Militarine溶液組胚胎發育在形態上與空白對照組比較無明顯差異，但隨著時間的推移，除質量濃度為 0.025，0.050，0.100 g/L 外，其他質量濃度組胚胎的尾部自主抽動次數與空白對照組比較有明顯差異（P＜0.05）。自主抽動是斑馬魚胚胎最初的運動特征，主要由脊柱運動神經元支配肌肉系統而發生［16］。隨著質量濃度的增加，斑馬魚胚胎的尾部自主抽動次數越少。在Militarine濃度3.2 g/L組中，斑馬魚胚胎未出現尾部自主抽動情況，表明在24 hpf時Militarine對斑馬魚胚胎脊柱神經系統或運動系統造成了一定影響。

心臟是胚胎發育過程中最早發育并發揮功能的器官，心率是體現心臟功能的一個重要指標，胚胎發育48 h后心率基本趨于穩定［17-18］。故選擇在此時測定其心率。結果表明，Militarine能使斑馬魚胚胎的心率明顯降低，且質量濃度越高，心率降低越明顯，說明高質量濃度的Militarine溶液會對胚胎發育產生心臟毒性。

表2 Militarine對斑馬魚胚胎死亡率和畸形率的影響（ ± s，%，n=3）

表2 Militarine對斑馬魚胚胎死亡率和畸形率的影響（ ± s，%，n=3）

質量濃度（g/L）0（空白對照組）0.025 0.050 0.100 0.200 0.400 0.800 1.600 3.200死亡率 畸形率72 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 5.56±2.40**9.72±2.41**23.64±4.81**37.50±4.17**63.89±4.81**73.61±8.76**96 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 8.33±4.17**13.89±2.41**25.00±4.17**38.89±4.81**59.72±2.41**83.22±7.22**100.00±0.00**144 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 11.11±2.41**16.67±4.17**30.56±2.41**65.28±4.81**98.61±2.41**100.00±0.00**100.00±0.00**72 hpf 0.00±0.00 6.94±2.40**13.89±2.41**26.42±4.84**48.61±2.41**59.72±6.37**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**96 hpf 0.00±0.00 34.72±2.41**50.00±4.17**63.89±6.36**77.78±2.41**81.94±6.36**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**144 hpf 0.00±0.00 52.78±6.37**75.00±4.17**88.89±2.41**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**

孵化率是斑馬魚胚胎毒性評價的重要指標。本研究結果顯示，48 hpf時，Militarine各質量濃度組能促進胚胎出膜；72 hpf時，0.050，0.100，0.200，0.400 g/L 質量濃度能促進斑馬魚胚胎出膜，3.2 g/L質量濃度能抑制斑馬魚胚胎出膜；96 hpf時，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L質量濃度能抑制斑馬魚胚胎出膜。給藥后，斑馬魚胚胎中質量濃度出膜較快可能是由于胚胎神經受到藥物的影響，產生興奮行為，較空白對照組出膜快，而高質量濃度由于濃度過高，神經由興奮變為抑制，因而出現出膜延遲或不出膜現象［19］。

結果表明，在同一時間點，隨著給藥質量濃度的增加（除 0.025 g/L 和 0.05 g/L 在 72 hpf時未出現死亡），斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率逐漸增加，與空白對照組比較有顯著差異（P＜0.01）；在同一質量濃度，隨著給藥時間的延長（除0.025 g/L未出現死亡），斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率逐漸增加，與空白對照組比較具有顯著差異（P＜0.01）。1.600 g/L，3.200 g/L 的斑馬魚胚胎在72 hpf出現心包水腫、色素沉積，且隨著時間的延長和濃度的增大，胚胎死亡率和畸形率呈現遞增趨勢，表明死亡和畸形情況與給藥時間和給藥濃度均相關。

綜上所述，Militarine溶液的濃度對斑馬魚胚胎發育的毒性存在量效關系，其作用時間長短對胚胎發育毒性也存在明顯的劑量效應，高濃度（1.600 g/L和3.200 g/L）Militarine溶液對斑馬魚胚胎發育影響顯著，主要表現在使神經、系統損害、心臟組織發育異常，生理上的運動功能喪失。雖然斑馬魚胚胎及幼魚對大多數藥物反應與人類臨床反應相似［20］，通過該試驗能為以后臨床用藥提供初步的數據參考，后續研究中將會用不同種屬的動物對Militarine的安全性進行全面的系統研究。