硝苯地平緩釋片Ⅰ體外溶出曲線方法研究及質量一致性評價*

李正凱 ，劉 靜△，潘永祥，張 靜，顏起航，靳如娜

（1.德州學院醫藥與護理學院，山東 德州 253023； 2.德州德藥制藥有限公司，山東 德州 253015；3.山東省德州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 德州 253048）

硝苯地平為Bayer公司研制的二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑，臨床用于預防和治療各種類型冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和心絞痛，以及各種類型的高血壓［1］，但半衰期較短，清除率高，作用持續時間短，患者血壓波動大。硝苯地平緩釋片能克服普通片給藥次數多的缺點，可減少由血藥濃度波動大而出現的頭痛、心悸、頭昏等不良反應，保證了藥物治療的長效性和平穩性［2］。目前，國產硝苯地平緩釋片Ⅰ均為仿制藥，常忽視對比性研究，導致原研藥與仿制藥有較大的質量差距。2012年，國務院印發《國家藥品安全“十二五”規劃》，提出全面提高仿制藥質量，對2007年修訂的《藥品注冊管理辦法》施行前批準的仿制藥，分期分批進行質量一致性評價［3］；《“十三五”國家藥品安全規劃》更是提出要加快推進仿制藥質量和療效一致性評價［4］。國內外很多藥檢機構及專家學者認為多種介質下的溶出曲線能較好地反映藥物體內療效，可用于口服固體制劑質量一致性評價［5-6］，原國家食品藥品監督管理總局于2016年制訂了《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》，以規范仿制藥質量一致性評價工作［7］。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法，以4種不同pH的溶出介質模擬胃腸道環境，分別測定不同時間點主成分釋放度，建立我國硝苯地平緩釋片Ⅰ體外溶出曲線測定方法，并采用該方法對國內11個廠家的硝苯地平緩釋片與原研藥的體外釋放行為進行一致性評價，擬為我國仿制藥硝苯地平緩釋片Ⅰ質量一致性評價工作提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；RC806D型溶出度測定儀（天津天大天發科技公司）；XS105DU型電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler公司）；KQ-200VDE型雙頻數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Smart2pure型純水儀（美國Thermo公司）。

1.2 試藥

硝苯地平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 100338-201103，純度為 99.9% ）；Adalat-L10（原研制劑，日本拜耳藥品株式會社，規格為每片10 mg）；硝苯地平緩釋片Ⅰ（仿制制劑，企業編號為A～K，規格為每片10 mg）；吐溫-80（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；無水乙醇（天津市恒興化學試劑制造有限公司）；鹽酸（分析純，萊陽市康德化工有限公司，含量為36% ～38%）；結晶乙酸鈉（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司，含量為99.0%）；無水磷酸氫二鈉（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團化學有限公司，含量為99.5%）；冰乙酸（分析純，天津市化學試劑制造有限公司，含量為99.5%）；磷酸（分析純，萊陽市康德化工有限公司，含量為85%）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Compass C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水（60 ∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：50 μL。在此色譜條件下，理論板數按硝苯地平峰計算應不低于4 000，拖尾因子應不大于1.5。在4種不同溶出介質中硝苯地平色譜峰的理論板數均大于4 000，分離度均大于2，拖尾因子均小于1.5。

2.2 釋放度測定法

取硝苯地平緩釋片Ⅰ6片，避光操作。參照日本橙皮書的釋放條件及2010年版《中國藥品檢驗標準操作規范》［8］，于4種溶出介質中測定釋放度。照2015年版《中國藥典（二部）》溶出度測定法（槳板法）［9］（即轉速為75 r/min，溫度（37 ±0.5）℃，溶出介質體積為 900 mL），依法操作，分別在進樣后 0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12 h時取樣10 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，并及時補充10 mL相同溫度的溶出介質，取續濾液作為供試品溶液。采用HPLC法測定，繪制釋放曲線。量取吐溫-80 3 mL，加水定容至1 000 mL，搖勻，即得水溶液溶出介質。取2.0g氯化鈉和7 mL鹽酸（稀鹽酸9 mL），吐溫-80 3.0 mL，加水稀釋，并定容至 1 000 mL，搖勻，即得 pH 1.2鹽酸溶液。取2 mol/L醋酸溶液20.5 mL，吐溫-80 3.0 mL，1.22 g 醋酸鈉，加入適量水混勻，加水稀釋，并定容至1 000 mL，搖勻，即得pH 4.0醋酸鹽溶液。取磷酸二氫鉀1.70 g和無水磷酸氫二鈉1.78 g，加適量水溶解，再加吐溫 -80 3.0 mL，加水定容至 1 000 mL，搖勻，即得pH 6.8磷酸鹽溶液。

2.3 標準曲線建立及線性關系考察

避光操作，精密稱取硝苯地平對照品9.81 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取貯備液 0.5，1，2，3，4，5 mL置50 mL棕色容量瓶中，加0.3%吐溫-80稀釋至刻度，搖勻，配制成每 1 mL 含硝苯地平 1.96，3.92，7.84，11.76，15.68，19.60 μg 的系列溶液，精密量取各50 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。以硝苯地平質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=168.66C+16.239，r2=0.999 3（n=6）。結果硝苯地平對照品溶液質量濃度在1.96～19.60 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4 方法學考察

專屬性考察：取C廠家硝苯地平緩釋片Ⅰ4片，分別置4種不同溶出介質中，按2.2項下方法操作，在0.25～12 h 不同時間點取樣，經 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，按擬訂色譜條件，進樣50 μL分析；同時分別取4種不同溶出介質經0.45 μm微孔濾膜過濾，記錄色譜圖，觀察在硝苯地平色譜峰附近有無雜質峰干擾，結果供試品溶液色譜圖中均未出現對主成分干擾的雜質峰，表明該法專屬性較強，可用于硝苯地平緩釋片Ⅰ中主成分的溶出度測定。

濾膜吸附試驗：取上述7.84 μg/mL對照品溶液，分成2份，1份直接按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀，測定峰面積（A1）；另 1 份分別棄去 3，5，7 mL，取續濾液，按相同方法測定峰面積（A2），計算回收率（A1/A2×100%），結果回收率為98% ～102%，濾膜吸附作用可忽略不計。結果見表1，樣品直接測定與濾膜過濾后測定峰面積回收率為98.4% ～98.0%，表明濾膜對樣品基本無吸附作用，即對試驗結果測定無干擾。

表1 濾膜吸附試驗結果

精密度試驗：精密吸取上述7.84 μg/mL對照品溶液50 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件重復進樣6次，測定峰面積，記錄保留時間，結果的RSD為0.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取C廠家硝苯地平緩釋片Ⅰ6片，在4種不同溶出介質（水溶液、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽溶液、pH 6.8磷酸鹽溶液）中，按 2.2項下方法操作，在12 h時取樣，濾過，精密吸取各續濾液50 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，結果的RSD分別為1.85% ，1.79% ，1.59%，1.22%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：分別取4種溶出介質（水溶液、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽溶液、pH 6.8磷酸鹽溶液）下，C廠家硝苯地平緩釋片Ⅰ在2 h時的供試品溶液，于0，2，4，6，8，12 h 時進樣 50 μL，測定峰面積，結果的RSD分別為 1.88% ，1.59%，0.39% ，1.35%（n=6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取4種溶出介質下C廠家硝苯地平緩釋片Ⅰ12 h時的供試品溶液，各精密量取3 mL，共9份，置10 mL容量瓶中，分別按樣品中硝苯地平含量50%，70%，100%的比例，加入上述硝苯地平對照品溶液（水溶液中分別加對照品溶液15.68 μg/mL 1 mL，19.60 μg/mL1 mL，19.60 μg/mL1.5 mL；pH 1.2 中分別加入 15.68μg/mL1mL，19.60μg/mL1mL，19.60μg/mL 1.5 mL；pH 4.0 中 分 別 加 入 15.68 μg/mL 1 mL，19.60 μg/mL 1 mL，19.60 μg/mL 1.5 mL；pH 6.8 中分 別 加 入 15.68 μg/mL 1 mL，19.60 μg/mL 1 mL，19.60 μg/mL 1.5 mL），用 0.3%吐溫 -80 稀釋，搖勻定容，濾過，按擬訂色譜條件進樣50 μL測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）

2.5 溶出曲線測定

硝苯地平緩釋片Ⅰ原研藥及國內11個廠家的仿制藥溶出曲線結果見圖1。結果，原研制劑在4種不同介質中釋放速率基本一致，且緩釋效果明顯；國內11個廠家的硝苯地平緩釋片Ⅰ體外溶出曲線與原研制劑釋放曲線均存在一定差異，普遍出現前4h釋放過快的問題，原研制劑在2 h時的釋放量在50%左右，4 h的釋放量在60%左右，而國內仿制制劑多數在2h時的釋放量在60%以上，在4 h時的釋放量在80%左右，緩釋效果較差。

國內不同廠家釋放曲線存在一定差異，且同一廠家的硝苯地平緩釋片在4種不同溶出介質中釋放曲線之間亦存在差異，國內除 B，C，J，K，I廠家的仿制藥在4種溶出介質中的釋放曲線接近一致外，其他廠家的仿制藥在4種溶出介質中的釋放曲線差異較大，其中A，D，E，F廠家尤為明顯，A廠家在pH 4.0溶出介質中釋放最快，D，E，F廠家在pH 6.8溶出介質中釋放最快。

圖1 原研藥及A-K廠家仿制藥在4種不同溶出介質中的釋放曲線

2.6 釋放曲線相似性比較

采用美國食品藥品管理局（FDA）推薦的f2相似因子比較法，50≤f2≤100可判定樣品和參比制劑釋放曲線相似，f2越接近100，相似性越高；f2＜50時，說明樣品和參比制劑釋放曲線不相似，結果見表3。可見，無1家的國產硝苯地平緩釋片Ⅰ在4種溶出介質中釋放曲線的f2＞50。僅C廠家的在水溶液及pH 6.8溶出介質中釋放曲線達到相似，在pH 1.2和pH 4.0溶出介質中釋放曲線接近相似；A，B，D，F廠家的在部分溶出介質中釋放曲線達到相似，其他廠家的在4種溶出介質中均不相似。結果表明，國內廠家的硝苯地平緩釋片Ⅰ仿制藥與原研藥釋放行為不一致，存在一定差異。

表3 原研藥與A-K廠家仿制藥釋放曲線的 f2相似因子考察結果

3 討論

3.1 測定方法選擇

目前，國內沒有硝苯地平緩釋片Ⅰ體外溶出曲線的標準測定方法，依據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》，并參照日本橙皮書，選用高效液相色譜法，考察硝苯地平緩釋片Ⅰ在水溶液、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽溶液、pH 6.8磷酸鹽溶液4種溶出介質的體外釋放情況。不同的是，日本橙皮書中采用甲醇 -0.01 mol/L 磷酸氫二鈉溶液（11∶9，V/V，用磷酸調pH至6.1）為流動相，而本法采用甲醇-水體系（60∶40，V/V），該流動相配制簡單，且避免了鹽水體系對色譜系統的堵塞。本試驗中選用了吐溫-80作為溶出介質的表面活性劑，未選用《中國藥典》中普遍采用的十二烷基硫酸鈉，主要原因考慮到十二烷基硫酸鈉對一些藥物主成分檢測有干擾，且采用吐溫-80作為表面活性劑，各廠家在截止時間點12 h的釋放度均在85%以上，符合溶出曲線測定的要求。

依據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》，在2 h之前采樣時間點較密集，2 h后間隔時間1，2，4 h時采樣，截止時間點為12 h，最后2個時間點溶出量大多在85%以上，且差值在5%以內，符合溶出曲線測定要求。

本研究中選取了與原研藥相似因子較接近的C廠家的仿制藥為研究對象，對4種不同溶出介質中同一時間點的供試品溶液，進行了穩定性、重復性及回收率等方法學考察。結果顯示，硝苯地平緩釋片Ⅰ溶出曲線測定方法準確、穩定、且儀器精密度高，該方法可為硝苯地平緩釋片Ⅰ原研藥與仿制藥體外溶出曲線的比較提供參考。

3.2 釋放行為與制備工藝相關性分析

溶出曲線測定結果顯示，國內大部分企業硝苯地平緩釋片Ⅰ仿制藥與原研藥體外釋放行為不一致，普遍釋放速度過快、緩釋效果不好，與原研藥存在一定差異。探究其原因，藥物制劑的體外釋放度與藥物制備工藝和制劑生產過程中原料藥及添加的輔料密切相關，各個廠家生產的硝苯地平緩釋片Ⅰ的制備工藝不同，添加的原輔料、處方也有差異，因此其釋放行為存在較大差異，其緩釋效果差異顯著。

原研制劑Adalat-L處方中包含硝苯地平、微晶纖維素、玉米淀粉、硬脂酸鎂等，其輔料均采用非緩釋用輔料，緩釋作用機制是利用了硝苯地平難溶性的特點，對硝苯地平原料進行微粉化處理，使其粒徑呈微細分布，在溶出介質中緩慢、逐步溶解，從而達到緩釋的效果，因此原研制劑在4種溶出介質中均勻速釋放。我國企業較多采用以親水凝膠材料如羥丙甲纖維素及羥丙纖維素等為基礎制備骨架型緩釋片，以生產硝苯地平緩釋片［10］。在體外溶出試驗時，緩釋骨架可能溶散過快或崩塌，導致緩釋作用降低，藥物釋放加快，出現突釋現象。另外，此種基質緩釋系統釋藥速度與外部環境變量有較大關系，易受如pH、溶出介質及攪拌速率的影響［11］，故這種制備方法所得仿制藥很難做到與原研藥釋放行為完全一致。

國產硝苯地平緩釋片Ⅰ存在降壓效果不穩，有一定不良反應［12-13］，針對此情況，想要真正實現仿制藥與原研藥的質量一致性，保證用藥的安全性和有效性，仿制藥在原輔料藥的優選、處方的研制、生產工藝的改進等方面仍需更深入地研究和提升。