補(bǔ)肺活血膠囊高效液相色譜特征指紋圖譜研究及多成分含量測定

舒 婷，黃湘杰

（湖南省湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院藥劑科，湖南 湘潭 411400）

補(bǔ)肺活血膠囊是由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂3味藥材經(jīng)水提醇沉濃縮而制得，具有益氣活血、補(bǔ)肺固腎之功效，對咳嗽氣促，或咳喘胸悶，心悸氣短，肢冷乏力，腰膝酸軟，口唇紫紺有一定療效［1］。其中，黃芪具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫之功效，含有黃酮類、皂苷類及多糖等化學(xué)成分［2-3］；芍藥占總處方量的40%，具有止痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)的藥理作用，主要活性成分為萜類、苷類、黃酮類［4-5］；補(bǔ)骨脂具有抗炎、補(bǔ)腎益陽及抗衰老功效，特征成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等呋喃香豆素類在高效液相色譜（HPLC）圖中可清晰分辨［6-7］。目前，藥典中對補(bǔ)肺活血膠囊的定量要求集中在黃芪甲苷和芍藥苷定量分析方面，并未涉及補(bǔ)骨脂，根據(jù)中醫(yī)理論，中藥的藥效是多成分聯(lián)合發(fā)揮作用，目前已廣泛運(yùn)用到中藥質(zhì)量分析和評價領(lǐng)域的中藥指紋圖譜，能全面整體地反映其所含化學(xué)成分的種類及數(shù)量，具有整體性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性［8-10］。2015年版《中國藥典》新收錄了9個中成藥制劑的指紋圖譜和28個特征指紋圖譜，以加強(qiáng)對中藥質(zhì)量的整體控制［11］。為了更全面地監(jiān)控補(bǔ)肺活血膠囊的質(zhì)量，完善其質(zhì)量評價體系，本研究中采用HPLC法建立了補(bǔ)肺活血膠囊的指紋圖譜，并對其中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素5種主要活性成分的含量進(jìn)行測定，為補(bǔ)肺活血膠囊的質(zhì)量評價和鑒定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，包括G1311A四元梯度泵，G1329A自動進(jìn)樣器，G1314B-DAD檢測器，G1316A柱溫箱，Agilent-Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；AUW-220D型電子天平（d=0.01mg，日本島津公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率為500W）；Milli-QIntegral5型超純水一體化系統(tǒng)（德國默克密理博公司）；《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版本）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（Calycosin7-O-β-D-Glucopyranoside，批號為 111920-201606，純度為97.6% ），芒 柄 花 素 對 照 品 （Formononetin，批 號 為111703-201504，純 度 為 99.9% ），芍 藥 苷 對 照 品（Paeoniflorin，批號為 110736-201842，純度為 97.4%），補(bǔ)骨脂素對照品（Psoralen，批號為110739-201637，純度為99.7%），異補(bǔ)骨脂素對照品（Isopsoralen，批號為110738-201715，純度為99.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（批號為AS18419），甲醇（批號為MS192707），均為色譜純，購自 Tedia company；磷酸（分析純，批號為20181225，永華化學(xué)科技有限公司）；補(bǔ)肺活血膠囊（市售，廣東雷允上藥業(yè)有限公司，批號分別為20180113，20180226，20180320，20180414，20180517，20180628，20180905，20181011，20181118，編號 S1 ～S9；廣東遠(yuǎn)大藥業(yè)有限公司，批號分別為180307，180513，180622，180916，編號 S10 ～S14）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

混合對照品溶液：精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品各適量，用甲醇超聲處理溶解，制得質(zhì)量濃度分別為2.0042，2.428 3，5.534 7，2.361 8，1.952 6 g/L 的混合對照品貯備液，分別精密量取 0.5，1，2，3，4，5，6 mL 置 50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得系列對照品溶液，室溫避光保存，備用。

供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，密塞，超聲處理（功率為450 W，頻率為40 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件［12-14］

色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.7% 磷酸溶液（B），梯度洗脫（按表 1）；流速：0.90 mL/min；柱溫：35 ℃ ；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，各組分色譜峰對稱因子為1.01 ～1.04，理論板數(shù)均大于 7 800。

表1 梯度洗脫程序與檢測波長

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

精密度試驗(yàn)：取樣品（批號為20181118），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，記錄色譜圖，以芍藥苷為參比峰，結(jié)果各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD分別為0.56%和0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為201811189），依法制備供試品溶液6份，在擬訂色譜條件下分析，記錄色譜圖，以芍藥苷為參比峰，結(jié)果各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD分別為 1.17%和 0.49%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為20181118），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于 0，5，10，15，20，24h時進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以芍藥苷為參比峰，結(jié)果各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD分別為1.05%和0.51%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

指紋圖譜的建立及相似度評價：按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下方法制備14批供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將14份指紋圖譜依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件，以樣品（編號為S1）的指紋圖譜作為參照圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.3，采用多點(diǎn)校正全譜匹配，生成指紋圖譜共有模式，并計算各譜與共有模式的相似度。結(jié)果在14批樣品指紋圖譜中，共得到18個共有峰，14批樣品指紋圖譜的相似度分別為0.986，0.993，0.991，0.994，0.989，0.987，0.989，0.987，0.986，0.992，0.998，0.997，0.996，0.995，均大于0.98，詳見圖 1。

圖1 補(bǔ)肺活血膠囊高效液相色譜指紋圖譜

部分共有峰指認(rèn)及相對峰面積計算：將指紋圖譜與混合對照品溶液色譜圖進(jìn)行比對，以保留時間為評價指標(biāo)，指認(rèn)出共有峰中5種化合物，其中芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的保留時間平均值分別為 27.95，33.02，35.11，43.89，45.51min。其中，芍藥苷峰信號強(qiáng)度較大，分離度良好，位置居中，選為參考峰，計算各共有峰的相對峰面積。由圖1可知，按指紋圖譜驗(yàn)證要求優(yōu)化色譜條件，得出18個成分，并進(jìn)行相似度計算，后期試驗(yàn)僅研究了5個主要有效成分，其余成分未作研究。結(jié)果見表2。

2.4 補(bǔ)肺活血膠囊中5個組分含量測定

線性關(guān)系考察及檢測限和定量限檢測：按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，分別精密量取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在試驗(yàn)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。分別取峰面積信噪比為10（S/N=10）和3（S/N=3）時的混合對照品溶液考察定量限（LOQ）和檢測限（LOD）。結(jié)果見表 3。

精密度試驗(yàn)：取同一批（批號為20181118）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為0.44%，0.51%，0.47%，0.36%，0.73%（n=6），表明儀器精密度良好。

表2 14批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積

表3 補(bǔ)肺活血膠囊中5個組分的回歸方程、LOD和LOQ

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為20181118）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于0，3，6，9，12，18，24 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為 0.91% ，1.10% ，1.32% ，0.34% ，1.23%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為20181118）樣品，依法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的平均含量分別為 3.272 5，3.051 1，10.212 0，2.785 6，2.223 6 mg/g，RSD分別為 0.85% ，1.01% ，0.66%，0.74%，0.92%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號為20181118）樣品，6份，每份0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，依法制備供試品溶液，精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素混合對照品貯備液溶液（質(zhì)量濃度分別為 2.004 2，2.428 3，5.534 7，2.361 8，1.952 6 g/L）0.3 mL，依法制備供試品溶液，搖勻，濾過，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積，計算各組分加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

樣品含量測定：取編號為S1～S14的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計算各成分的含量，結(jié)果見表5。

2.5 聚類分析［15-16］

將14批樣品中18個共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 22.0軟件，采用離差平方和法（Ward法），以歐氏距離平方為測度，采用系統(tǒng)聚類分析法進(jìn)行模式識別分析，結(jié)果見圖2。根據(jù)聚類分析樹狀圖，當(dāng)類間距介于10～25 時，14 批樣品可聚為兩大類，S7，S5，S8，S1，S6，S9，S2，S4，S3 為第 1 類，S12，S11，S10，S13，S14 為第 2類。第1類均為廣東雷允上藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，第2類均為廣東遠(yuǎn)大藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，說明同一廠家的產(chǎn)品質(zhì)量具有較高的穩(wěn)定性。

表5 補(bǔ)肺活血膠囊中5組分含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

圖2 14批補(bǔ)肺活血膠囊聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 色譜條件和提取方式優(yōu)化

考察流動相時，選用了甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-磷酸系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、乙腈-磷酸系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在流動相中加入一定比例的酸有助于改善峰形；又比較了乙腈-磷酸溶液（0.1% ，0.3% ，0.5% ，0.7% ）進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，以乙腈-0.7%磷酸溶液為流動相得到HPLC色圖譜峰數(shù)量最多且分離度好。試驗(yàn)中利用DAD在190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，為使毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素各成分均在其最大吸收波長下進(jìn)行同時測定，采用不同檢測波長不同時段切換：238 nm波長處檢測芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素，254 nm波長處檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素；曾比較不同提取溶劑（甲醇、80%甲醇、50%甲醇）、不同提取方式（浸漬過夜、加熱回流、超聲提取）、不同提取時間（30，35，40，45 min）的提取效果，以甲醇溶液超聲提取45 min時，各待測成分提取率高。

3.2 含量測定結(jié)果分析

將14批樣品中的5種有效成分含量結(jié)果輸入SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件的“描述性分析”，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量標(biāo)準(zhǔn)差值分別為 0.016 8，0.028 7，0.089 1，0.025 1，0.008 4，平均值分別為 3.281 2，3.056 9，10.218 0，2.777 6，2.223 8，且均在均值 95% 置信區(qū)間上下限區(qū)域內(nèi)，與平均值無明顯差異。即14批樣品中5種成分含量無異常值，說明補(bǔ)肺活血膠囊產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定。

本研究中建立的補(bǔ)肺活血膠囊的HPLC指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了對其質(zhì)量的全面綜合評價和分析；建立的HPLC法同時測定其中5種成分含量的方法簡單有效、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，可用于補(bǔ)肺活血膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量的同時測定，可為補(bǔ)肺活血膠囊客觀、系統(tǒng)的質(zhì)量評價提供參考。