丹皮酚對大腸癌細胞增殖、凋亡及自噬的影響

程 玉 李 明 譚詩云 周中銀

在全球惡性腫瘤中，大腸癌的發生率位居第4位，病死率位居第2位，每年有超過120萬新增病例，并有超過60萬病例死亡[1, 2]。外科手術是目前最有效的治療方法，而對于大腸癌晚期患者，放、化療則是主要的治療手段。盡管抗腫瘤治療不斷取得進展，但進展期大腸癌的總體療效仍不盡如人意。常規傳統的化療藥物毒性不良反應較大，對患者生活質量影響也較大，患者耐受差，因此，需要積極探索新的治療手段。自噬是廣泛存在于真核細胞內利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是細胞應對惡劣環境的生存機制[3～5]。經研究證實，自噬與腫瘤的發生、增殖、侵襲轉移等關系密切[6]。

丹皮酚(paeonol)是一種從牡丹中分離出來的天然酚類化合物，具有多種功效。其藥理學活性廣泛，鎮靜催眠、抗炎、抗腫瘤、肝腎保護、降低血糖、免疫調節、心血管保護、抗菌、解熱鎮痛、抗過敏、抑制血小板聚集和中樞抑制等作用[7～11]。本研究擬觀察丹皮酚對大腸癌細胞增殖、凋亡及自噬的影響，并探討其可能的作用機制。

材料與方法

1.藥品試劑:丹皮酚[寧波天真藥業有限公司(純度>98%)]；AnnexinV/PI試劑盒(德國Bender公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM/F-12培養液及蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；CCK-8試劑盒(上海同仁化學研究所)；細胞培養瓶、細胞培養皿、96孔及6孔培養板(美國Corning公司)；Bcl-2、Bax、自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白及內參β-actin抗體抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(武漢博士德生物科技有限公司)。

2.實驗細胞：大腸癌LoVo細胞(中國科學院上海細胞庫)。主要儀器：Cytoflex流式細胞儀(美國Beckman公司)、Enspire多功能酶標分析儀(美國PerkinElmer公司)、MCO-170MUVL培養箱(日本Panasonic公司)、GloMax 20/20型發光檢測儀(美國Promega公司)、LYNX 6000冷凍高速離心機(美國Thermo公司)。實驗分組：本實驗分為實驗組、空白組、對照組，實驗組和空白組分別加入濃度為0、30、60、120、240mg/L的丹皮酚，對照組不加丹皮酚。

3.細胞處理：大腸癌LoVo細胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件的恒溫箱中孵育，選取處于對數生長期的細胞，消化離心洗滌后重懸。根據不同檢測方法調整細胞接種濃度及培養時間。

4.CCK-8法檢測細胞活力：將上述處理后的大腸癌LoVo細胞按5×104/ml接種于96孔板，每孔200μl，培養24h至細胞貼壁。將上述貼壁細胞分別加入實驗組和空白組中繼續培養24、48和72h。到達預定時間后，每孔加入20μl的CCK-8試劑，待培養液顯色，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度值(A值)，根據公式計算細胞存活率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%，以細胞存活率表示細胞增殖情況。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：按1×105/ml濃度將大腸癌LoVo接種至6孔板內，每孔2ml，直至細胞貼壁。將貼壁后的細胞加入不同實驗分組中，處理48h后收集細胞，均加入500μl緩沖液進行重懸。各實驗分組中分別加入PI及Annexin Ⅴ試劑5μl，避光室溫孵育15min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

6.蛋白質印跡法檢測凋亡及自噬相關蛋白:用200μl預冷的含PMSF的蛋白裂解液裂解上述細胞，用移液器反復抽吸后震蕩、離心，將上清液移至經高壓消毒的EP管內。各組中取40μg等量蛋白行SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜，用5%BSA封閉，依據蛋白分子量進行相應切割，加入一抗，于室溫下孵育，2h后再次洗膜、顯色、顯影。根據蛋白測定試劑盒說明書檢測蛋白質濃度并計算蛋白質含量，采用蛋白質印跡法檢測蛋白質表達情況。

結 果

1.丹皮酚對大腸癌LoVo細胞增殖的抑制作用:經不同濃度丹皮酚處理LoVo細胞，分別于24、48、72h后結束培養，CCK-8比色法檢測細胞活力。在相同藥物濃度下，培養時間越長，細胞存活率越低；在相同作用時間內，丹皮酚藥物濃度越高，細胞存活率越低；同對照組(0mg/L)比較，差異有統計學意義(圖1)。

圖1 丹皮酚對大腸癌LoVo細胞存活率的作用與0mg/L比較，*P<0.05

2.丹皮酚對大腸癌LoVo細胞凋亡的誘導作用：采用PI/Annexin Ⅴ雙染標記，流式細胞儀檢測細胞凋亡率(圖2)。丹皮酚處理48h后可誘導LoVo細胞凋亡，30、60、120mg/L丹皮酚組的細胞凋亡率分別為13.43%±2.34%、22.26%±2.28%和36.25%±3.21%，與對照組的細胞凋亡率3.24%±1.35%比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖2 丹皮酚誘導大腸癌LoVo細胞凋亡散點圖A.0mg/L;B.30mg/L;C.60mg/L;D.120mg/L

圖3 丹皮酚對大腸癌LoVo細胞凋亡率的作用與0mg/L比較，*P<0.05

3.丹皮酚對大腸癌LoVo細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的作用:丹皮酚(0、30、60、120mg/L)處理LoVo細胞48h后，蛋白質免疫印跡結果顯示，隨著藥物濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量逐漸降低，同時促凋亡蛋白Bax的表達量逐漸增加(圖4)。

圖4 丹皮酚對大腸癌LoVo細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的作用

4.丹皮酚對大腸癌LoVo細胞自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達的作用:大腸癌LoVo細胞經不同濃度丹皮酚(0、30、60、120mg/L)處理48h后，蛋白質印跡檢測結果顯示，隨著藥物濃度的升高，自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達量逐漸增加(圖5)。

圖5 丹皮酚對大腸癌LoVo細胞自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達的作用

討 論

盡管近年來在腫瘤治療等方面取得了許多重大進步，新的抗腫瘤藥或方案層出不窮，但進展期大腸癌患者的生存率并未明顯提高，進展期大腸癌患者的生存率不足2年[12]。因此，新的抗腫瘤方法和策略成為腫瘤治療研究的重點。

丹皮酚是從中草藥牡丹皮中提取的天然酚類化合物，丹皮酚能抑制食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、腸癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤細胞的增殖；目前對丹皮酚的藥理作用已有了一定的了解，但丹皮酚對大腸癌細胞的作用機制仍有待于進一步闡明。本實驗不僅觀察了不同濃度丹皮酚對大腸癌LoVo細胞增殖、凋亡的影響，還通過自噬相關基因蛋白檢測探討其實現途徑可能是通過自噬實現的。

為了觀察丹皮酚對大腸癌LoVo細胞增殖和凋亡的影響，首先按照不同濃度梯度進行實驗分組，結果顯示隨著藥物濃度的升高，細胞存活率逐漸降低；同時，比較了相同濃度處理不同時間對細胞的抑制作用，結果發現隨著作用時間的延長，細胞存活率也逐漸降低，即丹皮酚對大腸癌LoVo細胞的抑制作用呈時間和濃度依賴效應。然后，采用PI/Annexin Ⅴ雙染檢測丹皮酚對大腸癌LoVo細胞凋亡率的影響，結果發現，隨著藥物濃度的升高，細胞凋亡率逐漸升高，呈量-效關系。上述兩者結果提示丹皮酚可抑制大腸癌LoVo細胞增殖并誘導細胞凋亡。

本實驗還對調控細胞凋亡具有重要作用的Bcl-2和Bax蛋白進行了探討，結果發現丹皮酚處理大腸癌LoVo細胞后，隨著藥物濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達量逐漸降低，且促凋亡蛋白Bax逐漸升高。細胞凋亡過程受凋亡相關蛋白的嚴格調控，Bcl-2與Bax均屬于Bcl-2家族，Bcl-2是細胞凋亡的關鍵抑制劑，其在多種實體腫瘤中高表達，包括大腸癌，Bcl-2在高分化癌癥中的表達更高[13]。Bax能促進細胞凋亡，并且Bax可直接激活死亡效應因子caspase導致細胞凋亡，且Bax與Bcl-2同源，Bax的過度表達可拮抗Bcl-2的抗凋亡效應，促進細胞凋亡，因此，Bax的存在可能與更好的預后相關[14]。

自噬是廣泛存在于真核細胞內利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，自噬的溶酶體降解途徑在細胞、組織和機體穩態中發揮著重要作用，控制自噬的基因突變與癌癥發生有明確的因果聯系。自噬在腫瘤發生、發展的過程中扮演著復雜又重要的角色，是一種細胞生存機制[15]。在形成腫瘤前自噬發揮抑癌作用，但當腫瘤形成后，因缺氧等不利因素，自噬維持腫瘤的生存功能[16]。本研究發現，丹皮酚處理后，大腸癌LoVo細胞自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達上調，提示丹皮酚可誘導大腸癌LoVo細胞自噬水平升高。

綜上所述，經丹皮酚處理后，大腸癌LoVo細胞增殖能力顯著降低，細胞凋亡率增加，且抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白量表達降低，促凋亡蛋白Bax表達量增加，同時，丹皮酚也可誘導LoVo細胞發生自噬。由此提示丹皮酚可能通過促進大腸癌LoVo細胞自噬抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，丹皮酚對大腸癌具有抗腫瘤作用，為大腸癌的治療提供了新的治療策略和方法。丹皮酚對大腸癌腫瘤侵襲的相關性報道仍較少，筆者也將進一步探討丹皮酚誘導的自噬在細胞增殖、凋亡和侵襲中的作用機制[17]。