支氣管肺發(fā)育不良早產(chǎn)兒血中RELM-β、VEGF表達(dá)及意義

邵 婕 徐 艷 王 軍

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產(chǎn)兒、尤其是小早產(chǎn)兒肺部常見疾病,近年來(lái)，伴隨醫(yī)療水平的改善，小早產(chǎn)兒成活率大大提高，隨之帶來(lái)BPD患兒人數(shù)增多；BPD病死率較高，存活者在早期離氧難、喂養(yǎng)難，嬰兒期肺功能較差，再入院率明顯高于正常嬰兒，給患兒家庭及社會(huì)帶來(lái)很大的精神、經(jīng)濟(jì)壓力。目前尚無(wú)有效的治療BPD的辦法，因此早期識(shí)別及預(yù)防BPD顯得尤為重要。RELM-β是一種在肺組織、血液、胃腸等組織表達(dá)的蛋白，在哮喘、COPD等多種呼吸道疾病中起到參與血管重建、調(diào)節(jié)肺纖維化進(jìn)程、發(fā)揮炎性效應(yīng)等作用，而BPD恰恰是炎性反應(yīng)修復(fù)的結(jié)果[1]；VEGF被認(rèn)為是一種促進(jìn)血管新生的重要因子，對(duì)肺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。本研究通過監(jiān)測(cè)早產(chǎn)兒生后血清RELM-β、VEGF水平變化，探討血清RELM-β、VEGF蛋白表達(dá)在早產(chǎn)兒BPD早期發(fā)病過程中的作用。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象與分組：選取2017年1月～2018年7月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科醫(yī)院NICU住院早產(chǎn)兒52例。納入標(biāo)準(zhǔn)：胎齡在28～32周且出生體重<1500g，入院后即應(yīng)用呼吸機(jī)支持且住院時(shí)間超過28天的早產(chǎn)兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天發(fā)育畸形、嚴(yán)重先天性心臟病、先天性腫瘤、遺傳代謝性疾病。根據(jù)有無(wú)BPD分為BPD組(n=24)和非BPD組(n=28) 。BPD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)國(guó)立兒童健康與人類發(fā)展研究院在BPD研討會(huì)中提出的標(biāo)準(zhǔn)：任何氧依賴(>21%)≥28d的新生兒即可診斷為BPD。本研究已通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，征得患兒家長(zhǎng)同意，并簽署知情同意書。

2.實(shí)驗(yàn)方法

(1)標(biāo)本收集及主要實(shí)驗(yàn)器材：收集患兒胎齡、出生體重、Apgar評(píng)分、性別、分娩方式等一般資料，于出生后3天內(nèi)、7天、14天分別采集外周血1ml，肝素抗凝管保存，采集標(biāo)本后 30min內(nèi)離心 15min(4℃，2000r/min，離心半徑為10cm)，分離血清，分別于-80℃冰箱保存。電泳儀(DYCZ-40) 購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自天津市漢中攝影材料廠。酶標(biāo)儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。抗人RELM-β、VEGF購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。人RELM-β、VEGF ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

(2)ELISA法檢測(cè)血清RELM-β、VEGF水平：從-80℃超低冰箱中取出保存的血漿，室溫解凍后離心(3000r/min，離心半徑10cm，離心15min)，待檢測(cè)。將各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡30min，并配制試劑備用。取出酶標(biāo)板，分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，輕輕晃動(dòng)混勻，貼上板貼，37℃溫育2h，棄去液體，甩干。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1h，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1h，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色15～30min。依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔吸光度(A值)，然后計(jì)算樣本濃度。

(3)Western blot法檢測(cè)血清RELM-β、VEGF水平：從-80℃超低溫冰箱中取出保存的上清液，采用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度水平，等量等體積(20μl)蛋白樣本上樣。采用 80V/120V電壓電泳，使檢測(cè)蛋白到達(dá)最佳分辨區(qū)；轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF膜上，用 Western 封閉液封閉 2h，分別孵育 RELM-β一抗(1∶1000)、β-actin 一抗(1∶1000)，4℃過夜；之后將 PVDF 膜在二抗 (1∶50000)中搖床孵育 2h；ECL增強(qiáng)液顯色；用掃描儀獲取圖像，運(yùn)用Image-J圖像分析軟件分析各目的條帶的灰度值。以RELM-β、β-actin 的灰度值比值確定RELM-β表達(dá)的相對(duì)水平。

結(jié) 果

1.一般資料分析:BPD組共24例，其中男性14例，女性10例，出生胎齡30.44±1.57周，出生體重1390±330g；非BPD組共28例，其中男性13例，女性15例，出生胎齡30.82±1.70周，出生體重1370±220g。兩組早產(chǎn)兒出生胎齡、體重、性別等，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 兩組早產(chǎn)兒臨床資料比較

2.ELISA法檢測(cè)兩組血清RELM-β、VEGF水平：兩組的血清RELM-β水平生后3天內(nèi)較低，隨后逐漸上升，14天達(dá)到高峰，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BPD組RELM-β水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間都高于非BPD組，3天內(nèi)兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，7天、14天兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。兩組的血清VEGF水平生后3天內(nèi)最低，后逐漸上升，14天最高，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BPD組的VEGF水平均低于非BPD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表2 各組早產(chǎn)兒不同時(shí)間點(diǎn)血清RELM-β水平比較

3.Western blot法檢測(cè)兩組血清RELM-β水平：兩組的血清RELM-β水平生后3天內(nèi)較低，隨后逐漸上升，14天達(dá)到高峰，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BPD組RELM-β水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間都高于非BPD組，3天內(nèi)兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，7天、14天兩組VEGF水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4、圖1。兩組的血清VEGF水平生后3天內(nèi)最低，后逐漸上升，14天最高，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BPD組的VEGF水平均低于非BPD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表5、圖2。

表3 各組早產(chǎn)兒不同時(shí)間點(diǎn)血清VEGF水平比較

表4 各組早產(chǎn)兒不同時(shí)間點(diǎn)血清RELM-β蛋白表達(dá)水平比較

表5 各組早產(chǎn)兒不同時(shí)間點(diǎn)血清VEGF蛋白表達(dá)水平比較

圖1 Western blot法檢測(cè)兩組血清RELM-β表達(dá)水平

圖2 Western blot法檢測(cè)兩組血清VEGF表達(dá)水平

討 論

支氣管肺發(fā)育不良發(fā)病原因多種，極低出生體重、機(jī)械通氣等為BPD的高危發(fā)病因素[2]。現(xiàn)多認(rèn)為BPD的發(fā)病是以遺傳易感性為基礎(chǔ)，宮內(nèi)、出生后多種不利因素的共同作用下引起肺損傷及損傷后異常修復(fù)， IL-8、TGF-β、MMP-9等多種細(xì)胞因子參與其中[3,4]。BPD尚無(wú)有效治療手段，且預(yù)后不佳。BPD患兒在新生兒期用氧時(shí)間長(zhǎng)，易合并早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、呼吸機(jī)相關(guān)肺炎等疾病，嚴(yán)重可致死亡；在嬰兒期至青春期，合并哮喘等呼吸道疾病的概率較大，神經(jīng)系統(tǒng)障礙發(fā)生率也顯著高于非BPD早產(chǎn)兒[5，6]。

抵抗素樣分子β(RELM-β)是抵抗素樣分子家族中的一員，目前被發(fā)現(xiàn)的家族成員還有RELM-α、resistin 、RELM-δ。RELM-β與RELM-α有密切同源性。在小鼠肺組織中，RELM-α通過ERK/MAPK-PI3K/Akt信號(hào)通路參與肺損傷后的肺血管重塑、肺動(dòng)脈高壓等過程，也參與小鼠支氣管肺發(fā)育不良的發(fā)病[7，8]。RELM-β最早在結(jié)腸發(fā)現(xiàn)，后來(lái)被證實(shí)在肺、心臟等組織中也有表達(dá)，RELM-β可作為促有絲分裂因子，誘導(dǎo)小鼠的肺纖維化，刺激氣道上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)黏蛋白、生長(zhǎng)因子等多種轉(zhuǎn)化介質(zhì)的產(chǎn)生，參與肺血管重塑[9]。有研究者在探究RELM-β在氣道重塑中作用的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RELM-β的表達(dá)增多時(shí)， RELM-β可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞增殖，通過ERK/MAPK-PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)分泌,這也說(shuō)明RELM-β與RELM-α在不同物種內(nèi)可能通過相似的通路發(fā)揮作用[10]。

VEGF在富血管組織中皆有分布，如腫瘤組織、肺組織等，在肺組織中，由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌，對(duì)肺血管的形成、修復(fù)起到舉足輕重的作用，可通過PLC-IP3-前列腺素通路改善血管通透性，經(jīng)PI3K/Akt-NOS-NO通路刺激血管新生，通過PI3K-PIP3-Akt/PKB通路信號(hào)通路減輕肺泡損傷，在慢性阻塞性肺疾病、非小細(xì)胞肺癌中與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。有研究表明BPD小鼠肺組織內(nèi)呈低水平的VEGF分布,提示低VEGF與BPD發(fā)病相關(guān)，應(yīng)用重組VEGF治療后的受損肺組織的肺泡數(shù)量及肺微血管密度得到一定程度的改善[12]。

綜上筆者推測(cè)，參與多種肺部、血管相關(guān)性疾病病理生理過程的RELM-β、VEGF在BPD發(fā)生過程中可能也發(fā)揮一定的作用。本研究中患兒胎齡、體重小，肺發(fā)育不成熟，絕大部分有氧氣應(yīng)用史，而在臨床治療過程中，呼吸支持常伴隨著氧供給、機(jī)械通氣損傷、氧自由基生成，損傷肺組織；另外宮內(nèi)、宮外感染等可引起炎性因子的大量釋放，造成氣道損傷，在各方面綜合因素影響下，導(dǎo)致了BPD的形成。本研究結(jié)果顯示，BPD組患兒各個(gè)時(shí)間點(diǎn)RELM-β表達(dá)均高于非BPD組，3天內(nèi)兩組RELM-β水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，7天、14天兩組RELM-β水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組VEGF表達(dá)水平生后3天內(nèi)最低，后逐漸上升，14天最高，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BPD組的VEGF水平均低于非BPD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，BPD早產(chǎn)兒RELM-β表達(dá)水平較高，而BPD早產(chǎn)兒VEGF表達(dá)水平則低于非BPD早產(chǎn)兒。

有國(guó)外研究提示BPD早產(chǎn)兒出生后體內(nèi)VEGF水平低于非BPD早產(chǎn)兒[13]。這與本研究結(jié)果相符合， VEGF水平表達(dá)減低和BPD的發(fā)病相關(guān)，聯(lián)合應(yīng)用VEGF、Ang-Ⅱ等干預(yù)后的BPD小鼠肺組織呈現(xiàn)出新生血管網(wǎng)增多、肺部炎癥及水腫明顯減輕等現(xiàn)象，提示VEGF參與肺損傷后的修復(fù)，BPD患兒體內(nèi)VEGF水平低恰恰可能導(dǎo)致肺損傷后修復(fù)不足[14]。前文提到RELM-β分泌增多后可刺激VEGF的正向生成，筆者推測(cè)，在BPD的病理生理改變開始后，機(jī)體可能通過代償性上調(diào)RELM-β的分泌，刺激 VEGF正向生成，從而促進(jìn)微血管新生，調(diào)節(jié)毛細(xì)血管通透性，改善肺泡氧合，對(duì)高氧、機(jī)械通氣等造成的肺損傷進(jìn)行修復(fù)，改善停滯的肺發(fā)育；當(dāng)病情進(jìn)展，肺損傷越來(lái)越重時(shí)，機(jī)體或選擇進(jìn)一步增加RELM-β的分泌來(lái)代償加重的肺損傷。

綜上所述，筆者推測(cè)RELM-β、VEGF可能作為保護(hù)性細(xì)胞因子，參與BPD患兒早期發(fā)病后的組織損傷修復(fù)，這為預(yù)測(cè)、干預(yù)BPD早期發(fā)病與進(jìn)展提供更多思路。但是本研究樣本量較小，追蹤時(shí)間較短，尚未監(jiān)測(cè)到RELM-β水平的高峰時(shí)間點(diǎn)，在接下來(lái)的進(jìn)一步研究中，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)監(jiān)測(cè)時(shí)間，深入探究RELM-β在BPD發(fā)展過程中的意義。