HPLC法測定中偏康合劑中黃芪甲苷的含量

鄧紹友 袁建平 李玲瑞 杜瑤 李孟林 呂艷

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法（HPLC）測定中偏康合劑中黃芪甲苷含量的方法。方法：采用 Agilent ZORBAX C18 色譜柱 （ 250mm×4.6mm，5μm） ; 以乙腈：水（32∶ 68）為流動相;流速為1.0mL/min;柱溫30℃，ELSD參數：氮氣流速為350kpa。結果：黃芪甲苷進樣質量在2.177～13.062μg范圍內與峰面積呈良好線性關系，r=0.9994，平均回收率為98.2%，RSD為0.95%。結論：該方法準確、快速、簡便可靠，結果穩定，可用于中偏康合劑中黃芪甲苷的含量測定。

【關鍵詞】 中偏康合劑;黃芪甲苷;HPLC

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2019）16-0060-03

Abstract：Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of astragaloside IV in ZhongPiankang mixture.Methods Agilent ZORBAX C18 column （250mm×4.6mm， 5μm）; acetonitrile： water （32∶ 68） as mobile phase; flow rate 1.0mL/min; column temperature 30℃， ELSD parameter： nitrogen flow rate 350 kpa.Results The injection quality of astragaloside IV showed a good linear relationship with the peak area in the range of 2.177～13.062μg， r=0.9994， the average recovery was 98.2%， and the RSD was 0.95%.Conclusion The method is accurate， rapid， simple and reliable， and the results are stable. It can be used for the determination of astragaloside IV in ZhongPiankang mixture mixture.

Keywords：ZhongPiankang Mixture; Astragaloside IV; HPLC

中偏康合劑為云南省曲靖市第一人民醫院制劑室研制的制劑，由黃芪、三七、當歸等組成，具有補氣、活血、化瘀、通絡等功效，主要用于氣虛絡塞、口眼歪斜、語言蹇澀、口角流涎、下肢瘺廢、小便頻數等癥。其中黃芪為君藥，首載于《神農本草經》，為豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，性溫，歸脾、肺經，具有補氣升陽、生津養血、行滯通痹等功效。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，具有抗炎、調節免疫、抗氧化、抗細胞凋亡、調節代謝、抗腫瘤等藥理作用[1]。2015版《中國藥典（一部）》以黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量作為黃芪質量評價指標[2]。中偏康合劑所含成分復雜，現行版質量標準中僅以薄層色譜法鑒別其中三七、赤芍兩種藥材，不能完全體現藥品的質量。為了更加有效對本藥進行質量控制，本實驗參照文獻[2-7]，以黃芪甲苷為定量指標，采用HPLC-ELSD法進行中偏康合劑中黃芪甲苷含量測定方法，為中偏康質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2030C 3D高效液相色譜儀（島津），ELSD-LTⅡ蒸發光檢測器，ME104電子分析天平，ME55電子分析天平。

1.2 材料 黃芪甲苷對照品（批號：110781-201616，純度為97.4%，中國食品藥品檢定研究院），乙腈為色譜純，水為超純水，其他為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Angilent ZORBAX C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-水（32：68），檢測器為蒸發光檢測器，流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，氮氣流速為350kpa。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品25mL，精密量取，置錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，加熱回流1h，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液25mL，蒸干，殘渣加水20mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次30mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品（含量97.4%） 11.1756mg，加甲醇溶解稀釋至25mL，制成每1mL含0.4354mg對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按中偏康口服液的處方和制法，制成不含黃芪的藥液，再按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性實驗 取2.2項下制備的樣品溶液按照2.1的色譜條件分別進樣10μL進行測定，結果顯示，色譜圖在黃芪甲苷對照品相應保留時間處無吸收峰，表明陰性對照無干擾。

2.4 線性關系考察 精密吸取2.2.2黃芪甲苷對照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL進樣，按“2.1”色譜條件下測定，以進樣質量的（X）為橫坐標，色譜峰面積（Y）為縱坐標進行計算指數，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y=X1.52644*EXP（9.93932）。相關系數為0.9994。結果表明，黃芪甲苷對照品在2.177～13.062μg范圍內，線性關系良好。

2.5 精密度考察 精密吸取2.2.2的黃芪甲苷對照品溶液20μL，按“2.1”色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜峰的峰面積，結果峰面積的RSD%為1.11% 。表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取中偏康口服液（曲靖市第一人民醫院，20171206）25mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.1”色譜條件下各進樣20μL進行測定，記錄色譜峰的峰面積，計算結果含量的RSD為1.17%。表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取中偏康口服液（曲靖市第一人民醫院，20171206）25mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、8、24、32、48h按“2.1”色譜條件下各進樣20μL進行測定，記錄色譜峰面積，結果峰面積的RSD為1.84%，表明樣品在48h內穩定。

2.8 回收率試驗 精密吸取中偏康口服液（曲靖市第一人民醫院，20190118，含量0.24mg/mL）12.5mL，共6份，精密吸取黃芪甲苷對照品溶液（0.9039mg/mL）3.0mL，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”色譜條件，精密吸取6份供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定，記錄峰面積，計算黃芪甲苷的平均加樣回收率，平均回收率為93.0%，回收率良好，RSD為1.25%，符合分析方法的要求。見表1。

2.9 含量測定取3批中偏康口服液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，外標法計算各供試品溶液中黃芪甲苷的含量。見表2。

3 討論

3.1 流動相選擇 先后考察了[7]甲醇-水（76∶ 24）及乙腈-水（32∶ 68）、（33∶ 67）、（36∶ 64）及流速分別為0.8mL/min和1.0mL/min，柱溫25℃、30℃、35℃的條件，結果發現，在乙腈-水（32∶ 68）作為流動相，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃的條件時，分離度良好，保留時間合適，且陰性對照溶液無干擾。

3.2 樣品制備方法選擇 分別考察超聲提?。?0min，60min，120min）和回流提?。?0min，60min，120min）兩種提取方法及不同溶劑（65%甲醇、85%甲醇、甲醇、65%乙醇、85%乙醇、甲醇），結果發現，回流提取率較超聲提取高，60min和120min提取的樣品含量較高，但差異不大，且甲醇提取效率較高。因此確定樣品制備方法為回流提取60min，甲醇作為提取溶劑。

3.3 氨試液萃取次數選擇 分別采用氨試液萃取0、1、 2、3 次，結果表明，洗滌2次、3次后樣品含量較高，且萃取 2 次與 3 次效果無明顯差異，因此采用氨試液2 次萃取。

綜上所述，本實驗采用高效液相色譜法測定中偏康合劑中黃芪甲苷的含量，方法簡便，精密度高，穩定性好，故可作為中偏康合劑質量控制的方法之一，為中偏康合劑質量標準的進一步完善提供依據。

參考文獻

[1]蔣微， 蔣式驪， 劉平. 黃芪甲苷的藥理作用研究進展[J]. 中華中醫藥學刊，2019：1-9.

[2]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫藥科技出版社，2015：302.

[3]王俐. HPLC-ELSD法測定黃芪口服液中黃芪甲苷的含量[J]. 藥學進展，2005（2）：82-84.

[4]趙靈芝，朱丹妮，嚴永清.HPLC-ELSD法測定黃芪中黃芪甲苷的含量[J]. 藥物分析雜志，1999（6）：403-405.

[5]翟宏宇，王海洋，凌潁. HPLC法測定丹黃祛瘀膠囊中黃芪甲苷含量[J]. 中國衛生工程學，2018（17）：99-101.

[6]袁林，冉麗娟.HPLC-ELSD法測定芪香益腎顆粒黃芪甲苷含量[J]. 現代醫藥衛生，2018，34（24）：39-40.

[7]陳健，向鵬宇.HPLC-ELSD法測定參芪五味子片中黃芪甲苷的含量[J]. 臨床醫藥文獻電子雜志，2019（20）：148.

（收稿日期：2019-06-18 編輯：劉 斌）