BHMT rs3733890基因多態性與葉酸治療河南漢族HHcy患者效果的前瞻性隊列研究

任炳楠，王連珂，田丹丹，王文華，田惠子，韓 涵，岳利敏，杜冰會，張衛東

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001 2)河南省人民醫院高血壓科 鄭州 450003 3)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)作為一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝的中間產物。健康成人空腹血漿Hcy水平是5～15 μmol/L，高于15 μmol/L可被診斷為高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)[1-3]。已經發現一些Hcy代謝相關的酶基因突變，或者一些特殊環境因素(如B族維生素缺乏等)均可導致Hcy代謝的紊亂，引起Hcy水平的異常升高，HHcy作為多種心血管疾病的獨立危險因素，已經嚴重威脅到了人類健康[4-5]。目前，口服葉酸作為最常見的治療手段，長期服用可以顯著降低20%～30%的總體Hcy水平[6-9]，但葉酸對于HHcy的治療效果仍然存在很大爭議，有許多病例療效仍不理想。大部分研究僅僅報道了葉酸長期補充后血漿Hcy水平的下降情況，而Hcy是否降至正常水平卻很少有人關注。

甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉移酶(Betaine-homocysteine methyltransferase, BHMT)參與了Hcy的再甲基代謝過程，其不依賴于維生素B12，并只活躍于肝腎細胞中[10]。人類的BHMT基因位于5號染色體，rs3733890是常見的突變位點，該多態性已經被證實同神經管畸形、唐氏綜合征、唇腭裂、宮頸癌、乳腺癌、頭頸部癌等多種疾病有關[11-16]。在該研究中，作者將探討BHMT rs3733890多態性與葉酸治療HHcy效果的關聯性，并分析基因-環境交互作用對療效的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象作者建立了一個前瞻性隊列研究，篩選于2014年7月至12月在鄭州大學第五附屬醫院神經內科就診的漢族患者作為研究對象。納入標準：①血漿Hcy水平>15 μmol/L，被診斷為HHcy。②年齡在18歲以上。③自愿參與本研究并接受90 d的葉酸補充治療。患者有以下任一條件則被排除：①使用過口服避孕藥。②患有嚴重感染、肝腎疾病、血液疾病、消化系統疾病、甲狀腺功能異常或惡性腫瘤。③過去2周內服用過B族維生素、抗癲癇藥、降壓藥、他汀類藥物或其他影響Hcy代謝的藥物(如甲氨蝶呤、阿司匹林等)。本研究由鄭州大學生命科學倫理審查委員會批準，所有患者或其親屬簽署知情同意書。

1.2基線調查與隨訪所有納入研究的患者均接受為期90 d的口服葉酸(5 mg/d)干預治療。通過調查問卷，在研究開始前收集患者的社會人口學資料(如年齡、性別、婚姻狀況等)和臨床信息。在干預治療前采集所有患者空腹靜脈血檢測Hcy。分別于治療中期(第45天)和治療結束時(第90天)進行2次電話隨訪，對服藥依從性進行評估。此外，于治療結束時進行第2次血漿Hcy水平的檢測。

1.3療效評估標準與分組依據根據第2次血漿Hcy水平評估療效。如Hcy水平≤15 μmol/L，認為葉酸干預治療有效，患者被納入治療成功組。反之，則認為干預失敗，患者被納入治療失敗組。

1.4實驗室檢查與基因分型實驗均在本課題組分子生物學實驗室進行。使用熒光偏振免疫分析法檢測空腹血漿Hcy水平。使用苯酚/氯仿提取全基因組DNA。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點的篩選標準為：①最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05。②連鎖不平衡r2>0.8。③功能性SNP。使用Sequenom公司的時間飛行質譜生物芯片系統(MassArray系統)對BHMT rs3733890位點進行基因分型。

1.5統計學處理采用SPSS 20.0進行數據分析。根據連續變量的正態性和方差齊性，選擇t檢驗或U檢驗比較兩組間變量的差異；分類變量使用百分比表示，使用χ2檢驗比較兩組間變量的差異。使用logistic回歸分析BHMT rs3733890基因多態性與葉酸治療效果的關聯性。使用分層分析探究基因-環境的交互作用。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組患者基線特征的比較共有1 071例HHcy患者納入本研究。在治療過程中175例服藥依從性較差或者中途失訪被排除，253例2次隨訪的服藥依從性均為一般，也從研究中排除。此外，有5例的基因型未被檢出，未納入分析。最終共有638例進入分析。結果見表1。由表1可知2組人群年齡、性別差異無統計學意義。治療失敗組吸煙、糖尿病、高血壓、冠心病患者的比例、基線血漿Hcy水平均高于治療成功組。

表1 2組基線特征比較

2.2BHMT rs3733890多態性與葉酸療效的關聯性該位點的基因型與等位基因在2組人群中的分布見表2。治療成功組人群的基因型分布符合哈德溫伯格平衡(χ2=0.06，P=0.972)。Logistic回歸結果顯示，相較于GG基因型攜帶者，AA型攜帶者葉酸治療失敗的風險更高。排除年齡、性別、吸煙、飲酒和婚姻狀況的混雜影響以后，關聯性依舊存在。

表2 BHMT rs3733890多態性與葉酸療效的關聯

*：調整年齡、性別、吸煙、飲酒、婚姻狀況

2.3BHMT基因-環境交互作用對葉酸療效的影響見表3。由表3可知，與攜帶野生型(GG)的不吸煙、不飲酒者相比較，攜帶突變基因型(GA+AA)的吸煙、飲酒患者葉酸治療失敗的風險顯著升高。此外，突變基因型與糖尿病、高血壓和冠心病史也存在著明顯的協同作用，葉酸治療失敗風險顯著升高。

表3 BHMT基因-環境交互作用對葉酸療效的影響

3 討論

HHcy作為一個危險因素，影響多種心血管疾病的發生和發展。大量的流行病學研究[4-8]已經證實，補充葉酸可以有效地降低血漿Hcy水平。然而，許多治療無效的病例卻沒有得到廣泛的關注。作者前期的研究[17]結果表明，在經過了90 d的葉酸(5 mg/d)補充以后，仍有超過40%的HHcy患者血漿Hcy水平沒有降至正常(5～15 μmol/L)。但關于治療失敗的原因，仍沒有一致的結論。

Hcy可以通過再甲基化過程形成蛋氨酸，這一過程包含兩條途徑。在最重要的第一條通路中，由5-甲基四氫葉酸作為甲基供體，在蛋氨酸合成酶的催化作用下，以維生素B12作為輔酶，將Hcy轉化為蛋氨酸，可降低血漿中Hcy的水平。而另一條通路則只存在于肝腎細胞中，以甜菜堿作為甲基供體，在BHMT的催化作用下，不依賴于B族維生素的輔酶作用，將Hcy轉化為蛋氨酸，并生成二甲基甘氨酸(dimethylglycine，DMG)[18]。作者先前在第一條代謝通路上的研究[19]已經證明，亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)的rs1801133和rs1801131位點，以及蛋氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase， MTRR)的rs1801394和rs162036位點的基因多態性同葉酸治療HHcy的療效存在關聯，并且rs1801133位點與冠心病和高血壓之間存在交互作用，直接影響到葉酸的治療效果。而目前缺乏關于第二條代謝通路的研究，僅有少數研究[20]表明，BHMT基因功能的改變可能會引起Hcy水平的升高，并進一步導致血管疾病風險的上升。作者推測：BHMT rs3733890基因多態性可能影響葉酸治療HHcy的效果，而基因-環境交互作用對于精準降Hcy可能有著更有效的預測作用。因此，作者通過在河南漢族HHcy人群中的前瞻性隊列研究來系統性地分析這些問題。

該研究結果顯示，BHMT rs3733890突變等位基因A和基因型可以升高葉酸治療HHcy失敗的風險；這一結果在排除相關混雜因素之后依舊成立。Li等[21]的研究發現，BHMT rs3733890位點發生錯義突變以后，盡管不引起酶活性的改變，但突變基因蛋白產物的米氏常數更低，與甜菜堿和Hcy之間的親和力更強，使再甲基反應更容易發生。然而，此反應也會產生過量的DMG。Liu等[22]研究結果顯示，DMG與Hcy水平之間存在正相關，DMG水平可以作為總Hcy水平變化的預測因子。因此，這也解釋了為什么攜帶突變基因的HHcy患者經過葉酸治療以后失敗比例更高。

Da等[11]在巴西人群中所做的研究發現，BHMT rs3733890 GA/AA基因型可與吸煙協同作用，升高頭頸部鱗狀細胞癌的發病風險。Hobbs等[23]的研究結果顯示，相較于體重正常且攜帶有GG基因型的女性而言，攜帶GA/AA基因型的肥胖女性生育先天性心臟病孩子的概率升高了1.8倍。盡管關于BHMT基因-環境交互作用影響葉酸療效的潛在機制尚未得到充分的研究，但有研究[11, 24]顯示，乙醇和尼古丁等有害物質的攝入會改變葉酸攝入與總DNA甲基化水平之間的關聯，提示吸煙和飲酒會通過影響體內一碳單位代謝，進一步影響到DNA的合成和甲基化水平。本研究結果也顯示BHMT rs3733890多態性與一些環境因素間存在交互作用，突變基因型對葉酸治療效果的影響被環境因素增強，導致了更高的失敗風險。因此，作者推測，BHMT基因與環境的交互作用可能會通過改變Hcy代謝和DNA甲基化水平，影響葉酸治療的結局。

總之，在河南漢族HHcy患者中，BHMT rs3733890基因多態性與口服葉酸治療HHcy的效果存在密切關聯，基因-環境的交互作用會直接影響到葉酸的療效。然而，由于研究的樣本量有限，并且在隨訪過程中存在著失訪和依從性較差等問題，因此，在下一階段，課題組將開展大型的多中心大樣本的研究，提升依從性，進一步驗證該研究結果。