沉默F(xiàn)OXC1表達(dá)對A549細(xì)胞化療敏感性的影響

葛路路，石 雁，朱靜靜，李艷娟，馬東波，王 靜，吳秋歌

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052 2)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 河南新鄉(xiāng) 453000

癌癥是全世界主要的公共衛(wèi)生問題，肺癌位居癌癥相關(guān)性死亡原因之首，預(yù)后差，其5 a生存率約為18%[1]，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的85%，大部分患者在確診時已屬中晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會[2]。以順鉑為主的一線化療方案是非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段，順鉑化療耐藥的出現(xiàn)是治療失敗的關(guān)鍵原因[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框C1(forkhead box C1，F(xiàn)OXC1)是叉頭框超家族的一個重要成員，參與胚胎的正常發(fā)育和器官形成的調(diào)節(jié)，越來越多的研究[4-6]指出，F(xiàn)OXC1不僅與鼻咽癌、口腔癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，還能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)FOXC1過表達(dá)可誘導(dǎo)散發(fā)性三陰性乳腺癌對蒽環(huán)類化療藥物的耐藥。本研究通過向肺癌A549細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA，觀察細(xì)胞對順鉑敏感性的變化及細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、FOXC1蛋白及mRNA表達(dá)的變化，以期為改善非小細(xì)胞肺癌化療耐藥、提高治療效果提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone公司；兔抗人FOXC1多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG-HRP二抗購自上海生工生物工程有限公司；FOXC1陰性對照(NC siRNA)、FOXC1 siRNA合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；BCA定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)取6孔板，將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞按8×104個/孔進(jìn)行接種，放置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.3不同濃度順鉑作用下細(xì)胞增殖活性檢測待細(xì)胞貼壁生長融合度達(dá)60%～70%，分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和FOXC1 siRNA。轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后分別加入0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 nmol/L順鉑繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收獲細(xì)胞，嚴(yán)格按照CCK-8檢測試劑盒說明書操作檢測細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞增殖抑制率=1-[藥物處理組A(570 nm)-調(diào)零孔A(570 nm)]/(對照組處理組A(570 nm)-調(diào)零孔A(570 nm)×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.4細(xì)胞分組取對數(shù)生長期細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時分組處理：空白對照組(不做處理)、轉(zhuǎn)染試劑組(僅給予轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000)、NC siRNA轉(zhuǎn)染組、NC siRNA+順鉑組、FOXC1 siRNA組、FOXC1 siRNA+順鉑組，每組均設(shè)3個復(fù)孔。依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，順鉑濃度和作用時間取4 nmol/L和24 h。

1.5各組細(xì)胞凋亡檢測按照1.4分組并收集培養(yǎng)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入Binding buffer制成1×106個/mL細(xì)胞懸液，每組取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITV和5 μL PI，室溫避光孵育15 min。使用BD LSRFTM流式細(xì)胞儀在30 min內(nèi)檢測，計算早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率。

1.6各組細(xì)胞中FOXC1、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測按照1.4分組培養(yǎng)并收集細(xì)胞，依據(jù)RNA抽提試劑盒說明提取總RNA，所有步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。FOXC1、Bcl-2和Bax引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析各組mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7各組細(xì)胞中FOXC1、Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá)的Western blot檢測按照1.4分組培養(yǎng)并收集細(xì)胞，離心后加入細(xì)胞裂解液提取蛋白樣品，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1體積比混勻，煮沸變性。通過SDS-PAGE分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，置入含50 g/L脫脂奶粉的封閉液(用1×TBST配制)中室溫封存1～2 h，分別加入兔抗人FOXC1多克隆抗體(按1∶1 000稀釋)，兔抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體(均按1∶2 000稀釋)，4 ℃過夜；次日復(fù)溫，30 min后TBST洗滌3次，5 min/次；后加入稀釋的二抗(按1∶5 000稀釋)室溫孵育1～2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL化學(xué)法顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)及Image J軟件分析，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA對順鉑作用下A549細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡的影響以及相關(guān)蛋白及mRNA的相對表達(dá)量的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染FOXC1siRNA依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果組對順鉑作用下A549細(xì)胞增殖抑制率的影響見表2。由表2可知，在各濃度順鉑作用實驗條件下，與轉(zhuǎn)染NC siRNA的A549細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA均表現(xiàn)出增強(qiáng)細(xì)胞增殖抑制率的效果(P<0.05)；進(jìn)一步將NC siRNA+順鉑組中的IC50[(4.66±0.58)nmol/L]與FOXC1 siRNA+順鉑組中的IC50[(2.08±0.69)nmol/L]比較，發(fā)現(xiàn)抑制FOXC1表達(dá)后A549對順鉑藥物敏感性顯著提高(P<0.05)。

表2 順鉑作用下A549細(xì)胞增殖抑制率(n=3)

2.2各組A549細(xì)胞凋亡的比較見表3。由表3可知，與其他組相比，F(xiàn)OXC1 siRNA+順鉑組A549細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率明顯提高。

表3 各組細(xì)胞凋亡率的比較(n=3)

△:與A、B、C組相比，P<0.05；*:與A、B、C、D組相比，P<0.05； #:與其他5組相比，P<0.05

2.3各組A549細(xì)胞中FOXC1、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達(dá)的比較見圖1和表4。與其他組相比，F(xiàn)OXC1 siRNA+順鉑組A549細(xì)胞中FOXC1和Bcl-2 mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量下降，而Bax mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量上升。

1:空白對照組;2：轉(zhuǎn)染試劑組;3：NC siRNA組;4：NC siRNA+順鉑組;5:FOXC1 siRNA組;6：FOXC1 siRNA+順鉑組

圖1各組A549細(xì)胞中FOXC1、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)

表4 各組細(xì)胞FOXC1、Bcl-2和Bax表達(dá)的比較(n=3)

△:與A、B、C組相比，P<0.05;*:與A、B、C、D組相比，P<0.05;#:與其他5組相比，P<0.05

3 討論

盡管目前靶向抗癌治療和免疫治療方法激增，但順鉑仍是治療肺癌最廣泛使用的一線化療藥物[8]，臨床化療耐藥性被認(rèn)為是晚期非小細(xì)胞肺癌患者治療失敗的主要原因[9-10]，并且可能受到多種因素的交互影響[11]。

FOX家族是一類成員眾多的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXC1編碼基因在人類中定位于6q25，基因全長3 500 bp，僅含1個外顯子，長為1 662 bp，F(xiàn)OXC1蛋白含553個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為56 700[12]。既往研究[13]表明FOXC1在NSCLC組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)。Chen等[14]的研究表明，F(xiàn)OXC1 siRNA能有效地沉默F(xiàn)OXC1在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)，并有可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。此外，F(xiàn)OXC1還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)，下調(diào)FOXC1表達(dá)有助于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[15-16]。FOXC1還可以作為乳腺癌常規(guī)化療藥物(如5-氟尿嘧啶、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、多西紫杉醇等)耐藥的調(diào)節(jié)器，F(xiàn)OXC1表達(dá)增加可明顯導(dǎo)致乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞對FEC化療方案耐藥，但是，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA抑制FOXC1在乳腺癌MA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)可提高對多西紫杉醇化療的敏感性[17]。

本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA抑制FOXC1在A549細(xì)胞中的表達(dá)；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA后可明顯增強(qiáng)A549細(xì)胞對順鉑的敏感性；且FOXC1 siRNA+順鉑組細(xì)胞凋亡率顯著高于其他組。因此，F(xiàn)OXC1的表達(dá)對A549細(xì)胞的順鉑耐藥性具有顯著性影響。此外，本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA在降低FOXC1表達(dá)的同時，可促進(jìn)凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)的下降和凋亡促進(jìn)因子Bax表達(dá)的升高。Bcl-2和Bax分別是最具代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡因子，其表達(dá)與調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑[18]。因此，抑制FOXC1的表達(dá)可能通過上調(diào)促進(jìn)凋亡因子Bax的表達(dá)、下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，提高A549細(xì)胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，通過轉(zhuǎn)染FOXC1 siRNA抑制FOXC1的表達(dá)，可明顯提高A549細(xì)胞對順鉑的化療敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)的下降和凋亡促進(jìn)因子Bax表達(dá)的升高。該研究結(jié)果可為后續(xù)提高A549細(xì)胞對化療藥物的敏感性研究，改善現(xiàn)有治療策略提供參考。